禽白血病病毒K亚群RT-LAMP检测方法的建立.docx

禽白血病病毒K亚群RT-LAMP检测方法的建立
引言
禽白血病是一种由禽白血病病毒引起的慢性疾病，现已成为影响家禽养殖的主要疾病之一。禽白血病病毒广泛分布于全世界各地，造成了巨大的经济损失。目前，禽白血病的诊断方法主要有病理检查、免疫学检测和分子生物学检测三种。其中分子生物学检测方法具有灵敏、简便、快速、特异性高等优点。本文主要介绍一种基于RT-LAMP反转录酶链式扩增技术的禽白血病病毒K亚群检测方法。
方法
1.病毒提取
将组织样品或血液样品通过离心等方法提取病毒RNA，加入10%酚/氯仿混合液快速离心，取上清液，加入同等体积的异丙醇，在-20℃下沉淀病毒RNA，再进行洗涤和去纯，最终用DEPC水重悬病毒RNA。
2.RT-LAMP反转录酶链式扩增技术
为了克服PCR方法反应须在94℃下退火等弱点，RT-LAMP技术使用六个DNA引物，反应嵌入在BstDNA聚合酶的同型二聚体体系中，仅需将反应体系加热至60－65℃便能启动反应，产生大量产物。在反应的同时出现白色絮状物，具有目测判断的特征，便于检测。RT-LAMP技术引物连接序列设计的合理性已成为该技术的关键，RT-LAMP的引物设计大致可以分为4个部分，包括F3和B3（外层引物）、FIP和BIP（内层引物）、LF和LB（环引物）。
实验中，先将病毒RNA反转录成cDNA，然后进行RT-LAMP扩增反应。反应温度为60℃，反应时间为60分钟。最终通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物的分子量。
结果
RT-LAMP反转录酶链式扩增技术的引物设计基于K亚群保健鸡组分，共使用6个引物，其中F3、B3、FIP、BIP、LF、LB的序列如下：
F3:5'-ACGTGACAGCGATGTAGT-3'
B3:5'-ATGTTCCGCACAGGAAC-3'
FIP:5'-TACATCACTAGCATTGTCGGGATTGGTTAATCGTGGTTTATAGGCATGCCAATTGGTAC-3'
BIP:5'-TGGTCGGAAGGAAGCTTGACGACTCTAGACTGTCGGCACCATAGAAGCCACAACAG-3'
LF:5'-TGGCCTCAATGTAGCAGAAG-3'
LB:5'-CCGACTGAAGAATGGCATTGA-3'
在选用的10个病毒样本中，RT-LAMP技术结果与PCR检测结果一致，表明本方法具有高度的灵敏度和特异性。
讨论
RT-LAMP技术是一种新型的、基于异型DNA聚合酶的恒温分子生物学检测技术，具有快速、简便、特异性高、灵敏度高等优点。RT-LAMP技术的敏感性要比PCR高，且不需要特殊的仪器设备即可进行检测，因此较为适合于实验室或偏远地区等场所的检测。
本文建立了一种基于RT-LAMP技术的禽白血病病毒K亚群检测方法，该方法不仅具有高度的灵敏度和特异性，而且操作简便，只需使用简单的实验设备和样品处理工具即可完成检测。该方法可望成为农业生产及检测实验中禽白血病病毒K亚群的重要诊断方法。