实验三.血浆蛋白结合率的测定.doc

院系：理学院专业：农药学学号：09310110020姓名：王熠
实验三：血浆蛋白结合率的测定
1、实验目的
测定磺胺嘧啶钠在不同动物体内的血浆蛋白结合率。

2、实验原理
将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。
具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中与亚硝酸发生重氮化反应后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，与经过同样处理的磺胺药标准液比较，用721分光光度计比色法测出组织中和不同时间的血液中磺胺嘧啶浓度。
由于亚硝酸不稳定，在实验中，用三氯醋酸与亚硝酸钠反应制的得。
剩余的过量亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去。

3、实验材料
1、实验动物
兔子一只。
2、设备与器械
712分光光度计、管状半透膜（周长5cm，长约12cm）、丝线、广口瓶、移液器。
3、药物与试剂
10%磺胺嘧啶钠注射液
15%三氯醋酸溶液
0.1%亚硝酸钠溶液
0.5%氨基磺酸胺溶液
0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液
磺胺嘧啶钠贮存标准液
磺胺嘧啶钠应用标准液

4、试验方法
1、试剂的制备
0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液：0.5g溶于95%乙醇约400mL中，再用乙醇稀释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存
透析液（PBS）：pH7.4的0.02M磷酸盐缓冲液，内含0.15MNaCl
磺胺嘧啶钠应用标准液：10%磺胺嘧啶钠注射液3.75μl溶于约80ml3%三氯醋酸溶液再定容于100ml容量瓶中备用
2、血浆制备
兔心脏采血，肝素抗凝，以3000rpm离心10min，取上清液即为血浆。
3、透析
将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端，袋口不得污染血浆。将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面，加0.05mg/ml的磺胺嘧啶钠溶液0.5ml于各瓶袋外透析液中。置广口瓶于冰箱中，平衡透析约60h左右。吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，无浑浊，说明无血浆蛋白漏出。取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。
4、用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度。
取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置2min，过滤，取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管；取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管；取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管，在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，放置3min，各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放置2min，各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液2.5mL，充分混匀，放置10min，用721分光光度计在550nm波长处比色：以空白管校正光密度到0点，读取标准管和测定管光密度，并用公式计算：

测定管光密度
游离磺胺药含量（mg%）=——————×应用标准液浓度×样品稀释倍数
标准管光密度
5、计算血浆蛋白结合率。
Dt-Df
fb=--------------×100%
Dt
fb：血浆蛋白结合率；
Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）；
Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度）

五、实验结果
1、结果记录
表一：标准管和测定管光密度的测定结果
样一样二样三平均值透析袋外0.0060.0080.0110.008
透析袋内0.0650.0900.0610.072
标准液0.6900.7010.6800.6902、游离磺胺药含量的计算
计算得：透析袋内药物浓度=0.000044mg/ml
透析袋外药物浓度=0.00039mg/ml
3、药物血浆蛋白结合率的计算结果：
兔：fb=88.9%

六、结果讨论与总结
1、分光光度计的使用操作。
由于应该使用一套比色杯来测定吸光度，而在实际操作中比色杯使用混乱，而且并没有做到严格的润洗，所以吸光度的测量存在较大的误差。
分光光度计的使用应该注意的事项：
（1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。
（2）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
（3）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。
（4）测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。