细胞一氧化氮检测-豆柴文库

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NOAssay
(BioAssaySystems--QuantiChromTMNitricOxideAssayKit)
原理:NO能被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，从而通过测定亚硝酸根离子NO2-/硝酸根离子NO3-的总量来确定NO水平。
样品制备：
1.用1mL枪头吸弃每孔上层细胞培养基1mL，先横刮3次再竖刮3次，刮起剩下1mL细胞培养液，然后用1mL枪头冲吹细胞3次，显微镜下计数细胞数，收集1×106细胞于1.5mL离心管中，置于冰上。
2.于40C，5000rpm离心3min，吸弃上清液，收集细胞沉淀。
3.向细胞沉淀中加入1mL冰上预冷的1×PBS液，用200uL枪头混匀后于40C，5000rpm离心3min。吸弃上清液，收集细胞沉淀，置于冰上。
4.向细胞沉淀中加入150uL细胞裂解液，用200uL枪头混匀后于冰上裂解30min。
5.于40C，12000rpm离心10min。
6.向150uL细胞裂解液中加入8uLZnSO4，vortex上混匀，然后加入8uLNaOH，vortex上混匀，于40C，14000rpm离心10min。取上清液，按50uL/管分装，作为NO检测样品。
标准曲线制作：
稀释标准品：取25uL1.0mM标准品，加入225uLddH2O，用200uL枪头混匀，将标准品稀释成100uMPremix。
按下表制作标准曲线：
No.Premix+ddH2ONitrite(uM)10uL+100uL0220uL+80uL20340uL+60uL40460uL+40uL60580uL+20uL80样品NO水平测定：
WR工作液配制：将25uLReagentA，25uLReagentB和50uLReagentC于1.5mL离心管中充分混匀。
样品及标准品反应：将50uL样品和标准品与100uLWR工作液于1.5mL离心管中混匀，于600C孵育10min。
测定：将反应好的样品与标准品加到96孔板中，于500-570nm(峰值540nm)测定OD值。
NO浓度计算：（按如下公式计算）
【NO】=(ODsample-ODblank)/slope(uM)，
注：ODblank为空白对照吸光值，slope为标准曲线斜率。其中1uMNitrite=30pg/mLNO