流式细胞术实验方法及应用.ppt

流式细胞术实验方法及应用科研型
分选功能
激光
四色荧光
(、、、）一、流式细胞术的原理的液流系统（如何形成单个细胞流）

近年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。速度快
极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个
细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析
可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细
胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把
细胞群分为各亚群。

定性、定量分析细胞
通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：、抗原或受体等进行定性、定量分析。
灵敏度高
荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于<个(如或)；前向角检测到小于颗粒。
分选感兴趣的细胞
纯度达，收获率可达。流式细胞术的应用范围
细胞大小
细胞表面分子系列
细胞浆内分子：胞内细胞因子
细胞核内分子：
细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度常用荧光素细胞表型分析：
双色分析：与
三色分析：双色分析
四色分析：三色分析
含量分析：
凋亡与坏死分析：
凋亡用双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备

骨髓、外周血、细胞株、组织器官、
胸水、腹水、尿液脱落细胞等

、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记，再溶血。单核细胞:
利用单核细胞在短时培养贴壁快
的特性（），可采用短时培
养获得较纯的单核细胞.

、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板吸去培养液洗次
胰蛋白酶℃，室温，含血清的培养基
吹打洗次单细胞悬液。
.组织器官单细胞悬液的制备

酶消化法

组织器官单细胞制备仪
剪碎法
机械法网搓法
研磨法
（）、酶消化法
组织块洗去血液剪成小块胰蛋白酶℃，含血清的培养基目钢筛网过滤目尼龙网过滤离心，洗次单细胞悬液。（）、机械法
单细胞制备仪
组织块洗去血液剪成小块制备仪
目钢筛网过滤目尼龙网过滤
离心，洗次单细胞悬液。
剪碎法
组织块洗去血液剪至浆状吸管轻轻吹打
目钢筛网过滤目尼龙网过滤离心，洗次单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液目钢筛网轻搓生理盐水
收集滤液目尼龙网过滤离心，
洗次单细胞悬液。
研磨法
组织块洗去血液研磨器研至匀浆目钢筛网
目尼龙网过滤离心，洗次
单细胞悬液。.石蜡包埋组织单细胞悬液的制备石蜡包埋组织制备单细胞悬液
石蜡包埋组织切片二甲苯脱蜡天水化
乙醇，蒸馏水组织器官胰蛋白酶℃，
冰目钢筛网过滤目尼龙网过滤离心，洗次单细胞悬液.脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞
冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液置℃冰箱中
沉淀取底部洗次
目尼龙滤网过滤单细胞悬液
收集方法、沉淀时间
胸水、腹水：胸、腹水，加入肝
素液，置于℃冰箱中静置
尿液：收集尿液，置℃冰箱中自然沉淀
冲洗液：生理盐水冲洗膀胱，冰箱内置
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。
间接标记是采用特异的无荧光标记的一
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加
入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原抗
体抗体复合物。其操作复杂、费时，目前
很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
接抗体，只能采用此方法。
直接标记是在标记时加入连接着荧光素
的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用
于各实验室。
根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内抗
原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤
.细胞表面抗原的标记法（外周血为例）
全血（×）相应抗体→避光孵
育→溶血素→室温→洗次
→上机分析（多聚甲醛固定）。
.细胞浆或核内抗原标记法
收集单细胞悬(×)固定剂室温，洗涤
去固定液破膜剂及抗体室温，洗涤次
上机分析（多聚甲醛固定）。
.细胞表面和细胞内抗原同时标记
在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。
常见细胞破膜剂：
皂角素、曲拉通()、乙醇、
商品化固定破膜剂（、）。、空白对照用缓冲液（）代替单克隆抗体进行实验
、阳性染色对照用现有试剂和方法检测已知表达某种特异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板时，可用被诱导活化血小板作为检测的阳性对照细胞。
.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴性细胞群，如双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主要是细胞），可作阴性对照。
.同型对照与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，如、七、荧光补偿
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域（门），对其中的细胞进行单参数或