基因工程第二章基因工程的基本操作程序优品文档.ppt

基因工程第二章基因工程的基本操作程序一.目的基因(TargetDNA)制备1、从生物基因组群体中分离目的基因A鸟枪法（霰弹法）染色体的切断1、染色体DNA的切断鸟枪法操作的改进（一）鸟枪法操作的改进（二）鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性BcDNA法提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子
融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性
真核表达系统:酵母,昆虫细胞,哺乳类动物细胞,植物细胞两大类
TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成
（1）cDNA第一链的合成
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
TTTTTTTTTTTTTT3’
融合蛋白（fusionprotein,包涵体）
筛选含目的基因的重组子
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
3‘HOCCCCCCC
1．如何获得目的基因片段？cDNA法克隆目的基因的基本方法（2）cDNA第二链的合成cDNA第二链的合成cDNA第二链的合成cDNA第二链的合成cDNA法克隆目的基因的基本方法cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序cDNA法克隆目的基因的局限性CPCR法由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆D化学合成法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针化学合成的单元操作二．DNA片段与载体DNA体外重组作为载体的DNA分子所具备的条件：
1、容易进入寄主细胞
2、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。
3、容易从宿主细胞中分离纯化

常用的载体：质粒、噬菌体、病毒和粘粒DNA重组技术TTTTTTTTTTTTTTp5’
4、mRNA差异显示法获得目的基因
融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性
1．如何获得目的基因片段？
CGG
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
neo：磷酸转移酶，使G418失活
expressedsequencetag
筛选含有目的基因的目的重组子
缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA
3‘HOCCCCCCC
由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题:
A
（3）大片段酶促法：
提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子
提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子
原核表达系统:大肠杆菌(1)粘性末端的连接(2)平末端的连接三．DNA重组体转入受体细胞2．DNA重组体进入受体细胞四、目的基因的筛选和鉴定bp
—1534
—994
—695
—515
—377
—237表达系统:表达外源基因的宿主细胞
原核表达系统:大肠杆菌
真核表达系统:酵母,昆虫细胞,哺乳类动物细胞,植物细胞两大类五、克隆基因的表达启动子序列融合蛋白（fusionprotein,包涵体）
表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。
大肠杆菌表达体系的不足
缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA
缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化
融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性
很难表达大量的可溶性蛋白真核表达体系tk-细胞突变株筛选转染细胞药物筛选转染细胞作业：
1．如何获得目的基因片段？
2．简述基因工程的基本操作程序
3.与原核细胞表达系统相比较,真核细胞表达系统的特点是什么?感谢观看