双向电泳技术2008a.ppt

双向电泳高分辨的双向电泳是由O’Farrell’s和Klose三十多年前各自创建的。1975年O’Farrell’s对E.coli提取物进行双向电泳后，成功地分离约1000个E.coli蛋白，从此拉开了双向电泳在蛋白组学中的研究序幕。双向电泳其原理简明，第一向沿水平方向按等电点不同进行分离（等电聚焦），不同等电点的蛋白质沿pH梯度分离，到达各自的等电点；随后第二向沿垂直的方向按分子量进行分离，它是目前蛋白质组学研究的核心技术。（一）等电聚焦电泳技术（isoelectricfocusing，IEF）1、等电聚焦原理+2、优点3、pH梯度的形成（2）天然pH梯度：pH梯度的选择4、两性电解质载体与支持介质1）两性电解质介质理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。2）常用的支持载体聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最为常用。电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在5%的三氯醋酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。两维间的平衡（二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）化学聚合和光聚合单体和双体在凝胶中的总浓度（T）

a代表单体的重量（g）；b代表双体的重量（g）；m代表溶液中的体积（ml）

交联度（c）双体占总浓度的百分含量
PAG浓度T%
Ｃ=2-6%二）聚丙烯酰胺凝胶的优点：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的样品中加入含有SDS和-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。
SDS与蛋白质结合后，蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。
电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。
十二烷基磺酸钠当蛋白质的分子量在15，000－200，000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系，符合如下方程式：
lgMW=－bmR+K
其中，MW为蛋白质的分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。双向电泳实验流程

样品制备（Samplepreparation）
固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）
第一向等电聚焦（IEF）
胶条的平衡（IPGstripequilibration）
第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）
凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
PDQuest软件分析（Softwareanalysis）
质谱鉴定（Proteinidentification）Two-dimensionalgelelectrophoresis