发酵分析—抗生素微生物检定法.ppt

抗生素微生物检定法前言前言1定义——抗生素微生物检定法1.定义－抗菌活性1.定义－抗生素效价定义1.定义－抗生素效价定义1.定义－抗生素微生物检定法1.定义－稀释法1.定义－比浊法1.定义－（琼脂）扩散法抗生素微生物检定方法比较：1.定义－管碟法2.原理－抑菌圈的形成2.原理－量反应平行线原理2.原理－量反应平行线原理3.检定方法二剂量法（2•2法）：用标准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤管碟法3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤标准曲线法（一剂量法）：
将标准品一组剂量的对数与微生物的反应绘制成直线图，相同条件下，测得供试品对微生物的反应值，在标准品的标准曲线上查出引起该反应的抗生素的相对浓度及效力。
一剂量法一般用于制备标准曲线或测定血药浓度。操作步骤－标准曲线法操作步骤－标准曲线法操作步骤－标准曲线法操作步骤－标准曲线法3.3检定方法操作步骤－三剂量法操作步骤－三剂量法操作步骤－三剂量法管碟法特点管碟法特点0个（cp2000)1.比浊法的定义2.检定原理2.检定原理3.比浊法的操作步骤：预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液浓度的吸收值在0.3~0.7范围；高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液浓度的吸收值的差值大于0.1为佳。试验准备：
比色管、搅拌转子、塞子的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

供试品、标准品溶液的制备：
估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
菌液培养基的制备：
根据预试验确定加入液体培养基的菌液量，注意制备菌液与培养基充分混匀。加抗生素溶液：
在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定量加入菌液培养基，混匀后，在规定温度培养。
菌浓度的测量：
在530nm或其他波长(580nm)处测定各比色管的菌液浓度，注意测定时间的一致性。
结果的可靠性检验及效价结果4.注意事项：比色池的清洁：测定用的比色管需用硝酸－硫酸（5：95）浸泡并用蒸馏水冲洗干净，不要有污渍和划痕，与分光光度计的试管要匹配，要清除抗生素残留和清洗液的痕迹，除去纤维等杂质。
时间的一致性：主要是使每管的培养时间相等，实验时在试管中加入含试验菌液的培养基后，应立即加入标准品溶液和供试品溶液，混合均匀。必要时可先将培养基冷却至2～4℃左右，再接种菌种，并在此温度下，将含菌培养基加至各试管中，可避免加注试管先后的误差。培养终止时将各管同时放入冰浴中，并尽快加入甲醛溶液灭活，使各试验管的培养时间一致。
测定时气泡的影响：在测定比浊法读数前必须将培养基充分摇匀才能准确测定细菌的浓度，但振摇产生的气泡严重干扰了测定结果。如在充分摇匀后放置一段时间，待气泡消失后再进行测定，虽然仍可逐渐下沉，但其误差较小。5.影响因素通气：
静置培养时，细菌慢慢沉降至底部，会产生梯度的微生物生长区和微生物代谢环境，表面为微亲氧性，底部为厌氧性。如采用振摇培养，可增加氧的供应，促进细菌生长，缩短培养时间。
菌液的浓度（吸光度）：
分光光度计最正确的测量范围在0.3～0.7。比浊测定时，控制菌液浓度的吸收度应控制在此范围内，可获得较为正确的结果。
菌液需新鲜配制：
当天使用，若放在冰箱放置一段时间后再使用，所测定的数据不稳定，误差大（金葡）。因为菌液在放置一段时间后，细菌老化死亡，但测定的吸收值不变，从而影响试验时活菌的量，使结果产出偏差。
注意菌种使用不超过5代。比浊法的特点：比浊法的特点：比浊仪可选择多个实验波长
根据药典采用了3个波长530、580、650，用户可以根据要求进行实验！自动判别，生成唯一报告

在生物生长过程中根据生物生长特性，自动判别，生成唯一报告
对微生物进行在线监测、测控、培养并在线完成测量
中国药典2005版比浊法品种：硫酸庆大霉素的效价测定（1）试验菌液的配制：取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时后，用0.9%灭菌氯化钠溶液洗下菌苔，并用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释，使其在650nm波长处的吸收值为1.0。
（2）含试验菌的液体培养基配制：取试验菌液1.5ml置100mlpH7.0～7.2培养基III中，摇匀，备用。
阳性对照：取1支试管，加入灭菌水1.0ml，再加入含试验菌的液体培养基9.0ml。
阴性对照（空白对照）：