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RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达

实验原理
细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。分离制备RNA是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA与其他成分分离，并保证RNA的完整性。
Trizol法
该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA的方法。Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。
RNA质量标准
RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减少RNA酶对RNA的讲解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度：A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。PCR
PCR
聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。利用两段已知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。其基本过程分为变性、退火、延伸三个步骤。变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。每次循环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。

RT-PCR
反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。
本实验先用Oligo引物反转录合成细胞cDNA模板，再用p53特异引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53基因在两种肺癌细胞的表达水平。

实验步骤
1、细胞RNA的提取及鉴定

2、RT-PCR检测p53表达

实验结果
RNA浓度=0.8299ug/ul
A260=20.748
A280=10.436
A260/A280=2.01
pcr结果

实验讨论
图中1、3、5、7组为A549细胞，是p53野生型，在390bp位置应产生扩增条带。2、4、6、8、9为H1299细胞，是p53缺失型在390bp处不应产生扩增条带。GAPDH为管家基因，在两种细胞中均应稳定表达，电泳后应在320bp处产生扩增条带。我们组做的是H1299型细胞，在390bp处未产生扩增条带，与实验结果相符（后来发现应该做A549，可能听错了，不过我们整个实验从细胞到之后的步骤都是按照H1299做的，结果没有问题）。
本实验室，除了第3组以外其他组的实验结果均与预期相符。第3组为A549但未在390bp处产生扩增条带，第3组做了GADPH的阳性对照，结果在320bp处出现了扩增条带，所以认为该组实验操作、RNA提取、pcr过程等均没有太大问题。分析可能原因，据该组同学表示，他们在实验中间因为离心时液体洒出，曾经换过一次细胞，不确定老师给他们地是否还是A549型细胞。
本次实验中我学会了以下几点：
提取RNA并防止RNA被降解，在提取RNA过程中要需要保证蛋白质分离干净以及抑制RNase活性与外界RNase混入体系使得RNA降解。
为了使得RNA与蛋白质分离在萃取过程中要充分震荡混合。
RNase无处不在，提取RNA时要格外注意。
可以用A260/A280比值来判断RNA提取纯度，A260/A230表示碳水化合物如盐的混入程度。
pcr变性后要立即置于冰上，防止双链再结合。
GAPDH为管家基因，稳定表达于各种细胞，可以用于做阳性对照。
跑胶加样前要设计好每孔加什么，不要再出现这次的混乱现象。
拿试剂时要看好老师的要求，不要再拿错了。
思考题
测定A260、A280、A260/A280的意义？
A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。A280是是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。A260/A280可进行核酸样品纯度评估,纯RNA比值为2.0，一般提取RNA比值在1.7~2.0间较为合适，低于1.7表明有蛋白污染，大于2.0可能出现一般降解，如重复读数无误并不表示纯度有问题。
如何避免RNA的降解？
需要创造一个无RNase的环境，并在操作各个环节尽量避免RNase的污染。如实验中加入异硫氰酸胍、RNasin为RNase抑制剂，再如实验操作中要专门使用无RNase的水以及枪头，实验要戴口罩以