氨基酸的鉴定(纸层析法).doc

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氨基酸的鉴定(纸层析法)

1、掌握纸层析法的基本原理
2、通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并学会分析未知样品中的氨基酸组分。实验原理：
1、层析法又称色谱法(Chromatography)，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附办、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。
2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动相)
沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示：
3、在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
4、本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。试剂：
1、酸性展层剂正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2<V/V>
2、显色储备液：0、4mol/L茚三酮-异丙醇:甲酸:水=20:1:5<V/V>
3、标准氨基酸溶液(6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His)
4、未知样品液：上述4种氨基酸中的一种或几种混合液(每组任选一个样品)实验器材：
1、滤纸
2、烧杯
3、剪刀
4、毛细管
5、层析缸
6、微量注射器
7、电吹风
8、保鲜膜操作方法：
1、点样
1、量取30ml层析溶剂、1ml显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。（展层缸洗净后应除去多余的水，否则会影响展层溶剂的比例而影响展层）
2、戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪裁为18cm14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。（点样操作时应戴手套，防止样品及滤纸受污染）
3、用毛细管将标准氨基酸及未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。
2、层析与显色
1、将滤纸卷成圆柱形，用针线缝合或钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。
2、将滤纸竖直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖(点样点的一端在下，展层剂液面需低于点样线1cm左右。
3、待溶剂前沿线距滤纸末端1~2cm(展层长度10cm，约2hr)
时，取出滤纸(需带上手套)
4、用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹千(通风橱中进行)，即可见层析斑点。结果处理：用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到溶剂前沿的距离。计算各种标准氨基酸的Rf值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。
点样点1-His2-Phe3-Gly4-Pro5-A18距离/cm点样点到层析点中心0、
85、
61、
63、
60、9/3、9/6、2点样点到溶剂前沿8、
68、
68、
58、
68、6Rf(His)=0、8/8、6=0、093Rf(Phe)=5、6/8、6=0、651Rf(Gly)=1、6/8、5=0、188Rf(Pro)=3、6/8、6=0、419样品：下：Rf=0、9/8、6=0、105中：Rf=3、9/8、6=0、453上：Rf=6、2/8、6=0、721混合样品中氨基酸的组分为：His、Pro、Phe误差分析：
1、样品点样不足，显色不明显。
2、点样时温度较高，氨基酸浓度发生变化。
3、滤纸边缘不齐，影响氨基酸扩散速度。
4、显色时，热风温度不够，显色不明显。
5、测量不精确，扩散距离存在误差。注意事项：
1、严格控制点样位置以及点样直径，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，同时点样点应高于展层剂液面。
2、点样时宜采用冷风吹干。
3、展层剂需临用时配制，以免发生酯化而影响层析结果。展层剂比例应保持不变，因此展层缸应保持干燥。
4、若样品中溶质种类较多，且某些溶质在一种溶剂系统中的R值分接近时，单向层析分离效果不佳，可采用双向层析。
5、滤纸垂直放置高度不能超过层析缸的高度，滤纸边缘不可触碰到层析缸边缘，否则沿线上升速度偏差会很大。