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分子生物学实验方案设计（五篇模版）

第一篇：分子生物学实验方案设计梅衣属ITS条形码物种的快速鉴定实验目的：一、学习并熟练地衣DNA提取技术二、掌握PCR技术的原理及操作三、DNA条形码技术的应用实验技术路线：1、地衣总DNA的提取2、PCR扩增3、基因测序4、基因序列对比地衣总DNA提取：1.取带有子囊盘或未有子囊盘的带藻地衣体30~300mg，用无菌水冲洗，除去表面杂质，再用DNA提取液浸泡2~3h（4℃）。2.将地衣体取出，滤纸吸干表面液体，剪碎放于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状。3.将粉末小心、全部转入1.5ml离心管中，加入400μLDNA提取液，混匀。4.加入10%SDS50μL、氯化苄150μL，振荡混合，于50℃保温1h，每隔10min振荡混合一次。5.保温1h后，每管加入3mol/LNaAc50μL，混匀冰浴15min.6.用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和等体积酚：氯仿（1：1）各抽提一次，直至无白色沉淀为止。7.移上清液于另一离心管，加入2倍体积无水乙醇，4℃放置2~3h，15000r/min，离心10min（4℃），弃上清液。8.将沉淀用70%乙醇冲洗2次后，真空干燥，再加入50~80μLTE缓冲液，保存于冰箱（4℃）PCR扩增：稀释50倍用于后续PCR操作。真菌ITSrDNA由通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，反应32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，PCR产物通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验,ABI3730DNA分析仪测序。序列比对：所获测序结果序列包含小亚基部分结尾序列、ITS1-5.8S-ITS2、大亚基部分起始序列，去除大小亚基部分序列后所得片段大小约500bp，即为所需的序列利用DNAMAN（LynnonBiosoft）软件将测序结果同GenBank下载数据进行比对分析，如果序列长度不同，则只保留共有区段。如果该DNA序列与GenBank中梅衣属的某个种的序列相同，则可确定所测定的地衣是哪个种。实验试剂：一、DNA提取1、DNA提取液（50mmol/LTrisHCLpH9.0;12.5mmol/LEDTApH8.0）:（1）称取7.5712gTris,加入150ml蒸馏水，加HCL调pH至9.0，定容至250ml（2）称取3.6531gEDTA，加入20ml蒸馏水，调pH至8.0，定容至250ml2、10%SDS:称取10gSDS，加入100ml蒸馏水3、NaAc：0.51g醋酸钠固体，加蒸馏水溶解，定容25ml4、TE缓冲液：（1）1mol/LTris-HCL(pH8.0)1ml(2)0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2ml超纯水至100ml5、氯化苄二、pcr试剂准备1.DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCRBuffer4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、详细配制比例1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix（2mM）4μl引物1（10pM）2μl引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μlDNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA2μL引物11μL引物21μLdNTP1.5μLMgCl22μL10×buffer2μLddH2O10μLTaq酶0.5μL第二篇：分子生物学实验总结分子生物学实验1.TOMY全自动灭菌锅的使用（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。（2）SET键设置温度和时间（121℃，20min）（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，CheckHeat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。（5）腔体内经常清洁。2.LB液体培养基（1000mL）将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000mL，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。固体还要再加琼脂。3.碱裂解法碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这