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医学分子生物学与实验

第一篇：医学分子生物学与实验1.简述动物组织蛋白质，DNA,RNA提取的大致过程及原理。答：共同的第一步都是取动物组织进行清洗剪碎，然后用高速组织捣碎机破碎。DNA的提取：通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。RNA的提取:取组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚液，室温下剧烈振荡10分钟。置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。蛋白质的提取:1.组织称重，切小块放入管中。2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液，5μlPMSF和5ul磷酸酶混合液）。3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。4.用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。5.裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，因此在提取和制备DNA或RNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。提取出DNA或RNA-蛋白质复合体（DNP）后，在将其中的蛋白质除去2.简述基因工程的原理及过程。答：基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。所谓基因工程（geneticengineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。一般步骤：1克隆重组：提取供体生物目的基因，酶解，连接到另一个DNA分子（克隆载体）上形成重组DNA；2转化：将重组子转入受体细胞，并在其中复制保存；3筛选鉴定：已吸收重组子的细胞；4大量培养监测外源性基因是否表达。3.比较原核生物与真核生物的基因表达调控机制。答：原核生物基因表达调控真核生物基因表达调控启动因子：σ因子决定RNA聚合酶识别的特异性TF2D决定RNA聚合酶识别的特异性转录激活：操纵子调节蛋白顺式作用元件转录因子主要机制：操纵子模型具有普遍性顺式作用元件具有普遍性主要为负性调节（阻遏调节）主要为正性调节特有机制：转录衰减染色体结构变化共同点：1.基因表达都有时间特异性和空间特异性2.基因调控的多层次性和复杂性3转