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细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结

第一篇：细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8法实验原理：CellCountingKit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2.CCK-8法能快速检测；3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；4.CCK-8法的重复性优于MTT法，MTT实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。三、所需设备及仪器：1.10ul，100-200ul及多通道移液器2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板4.二氧化碳培养箱一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。实验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。6、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。五、实验注意事项：·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。·CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果