酵母菌分类学的研究进展王志伟.docx

酵母菌分类学的研究进展王志伟

第一篇：酵母菌分类学的研究进展王志伟酵母菌分类学的研究进展07级农学系生物技术2班王志伟0701024208一、摘要随着生物技术的发展,一些新方法应用于酵母菌分类中,使酵母菌分类学研究从过去的传统分类系统过渡到以遗传特征（DNA序列）为主要依据的现代分类系统。本文将介绍脉冲电泳核型分析(PFGE)、PCR-LFP和RAPD3种分子生物技术的方法、原理,以及在酵母菌分类鉴定方面的应用现状,并指出了各种技术的局限性和应用前景。关键词：脉冲电泳核型分析(PFGE)PCR-LFPRAPD应用进展二、简介经典分类学方法在酵母菌分类中的应用经典分类学方法是酵母菌分类学方法的基础,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等;生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。但是，随着酵母菌资源库不断丰富和新种不断被发现，单靠经典的形态学和生理生化差异作为酵母菌种间鉴别依据有时是不够的。所以现在该法只能作为酵母鉴定系统的基础辅助其他分类方法使用。三、分子分类学方法在酵母分类中的应用rDNA序列分析是近年来广泛应用的用于判断不同分类群亲缘关系远近的指标,在rDNA中,26SrDNA(LSU)和18SrDNA(SSU)以串联重复的方式排列,在细胞内有数以百计的拷贝,增加了扩增成功的可能性。rDNA内某些片段具有高度的保守性,同一细胞内不同拷贝的rRNA基因序列,因协同进化作用而被均一化,因此每一拷贝的序列是相同的。当前酵母分类中最为常用的包括18SrDNA、26SrDNAD1/D2区、ITS区等[1]。序列分析的大致流程是:活化菌株,提取目的菌株的基因组DNA,并以此为模板使用酵母菌通用引物扩增相应的区域,扩增产物经电泳检测,纯化后进行测序;将测序得到的序列提交到Genbank等核苷酸数据库,与库中所有酵母菌的同源序列进行相似性比较,与相似度最高的序列的碱基差异越小,成为该序列所对应菌种的可能性就越大。也可以从核苷酸数据库中下载同源序列,构建系统发育树,研究菌株的系统发育地位。3.1脉冲电泳核型分析(PFGE)：脉冲电泳是一种可在琼脂糖凝胶中将不同大小的完整染色体DNA分子分开的技术；核型分析就是应用脉冲电泳方法发展起来的一种新的实验技术,把整个染色体包埋在琼脂糖凝胶中,依赖染色体的大小和立体结构（代表了一个生物所含有遗传物质的多少及其组成形态,该特征随物种变化而变化,因而具有特定的系统分类学意义）及在凝胶中的不同迁移速度把基因组分离成染色体带[2]。简要的实验步骤包括原生质体制备、制胶、电泳、凝胶的溴化乙锭染色观察4个过程。而影响PFGE成败的因素主要有两种:一是完整染色体DNA的制备,二是合适的脉冲电泳条件。脉冲电泳的原理是通过电场不断改变,迫使DNA分子的泳动方向做相应的改变,小的DNA分子比大的变形快,故前者比后者泳动速度快,从而将不同大小的DNA分子分开[3]。随着脉冲电泳仪的改进以及完整染色体DNA提取方法的发展,脉冲电泳技术越来越多的被应用于酵母菌的分类学研究中，又因为PFGE分析带型清晰易辨、分辨力较强,可达10000kb以上,适用于近缘关系菌株的分类研究，可作为变种鉴别和种内分型的新基因型方法，故而它对于酿酒酵母菌在传统方法分属后的进一步分类有重要作用。3.2限制性片段长度多态性DNA(PCR-LFP)RFLP即限制性片段长度多态性(restrictionragmentlengthpolymorphism)是REFP的改进形式,它采用DNA探针和分子杂交技术,特异性更强。PCR-LFP是将PCR扩增的基因组DNA用限制性内切酶酶解,经电泳分离后表现的限制性片段长度差异，酵母基因组含有丰富的遗传信息,且有较大差异,不同菌株的同源序列（5.8S-ITS区域的PCR-RFLP使用得最为广泛[4]）肯定具有不完全一致的酶切位点，,这为该方法在酵母菌分类上的应用提供了可能。，核糖体存在于所有生物细胞中,几乎有一个共同的起源,而且某些rRNA序列对所有的同源生物是相当保守的,从而可以确定所有生物的分类地位。核基因组rDNA的内转录区间ITS(InternalTranscribedSpacer)适用于种以下的分类和鉴定。利用引物扩增rDNA的ITS区域,用限制性内切酶消化,不用杂交,也可获得RFLP图谱。FERNANDEIESPLNAR等扩增5.8SrRNA,包括了内转录区间ITS1和ITS2,扩增后的基因数目从700～870bp不等,以此对酵母菌进行RFLP鉴定分析[3]。Kuhlea等(2001)用PCR-FLP分析法分析了啤酒中的酵母类群CECT-AT