血红蛋白的提取和分离专家讲座.pptx

本课题学习目标本课题学习重点和难点4月14日宣告人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代血液血红蛋白1.分离生物大分子基本思绪：（一）凝胶色谱法（分配色谱法）4.凝胶色谱法分离蛋白质原理和详细过程凝胶色谱法分离蛋白质过程动画演示（二）缓冲溶液缓冲溶液组成及分类（三）电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于它所带净电荷多少以及分子大小等原因。（SDS作用）为了消除净电荷对迁移率影响，能够在凝胶中加入SDS。用SDS测定蛋白质分子量方法二、试验操作采集得到血液柜式离心机首次离心后结果3次洗涤后结果(2)血红蛋白释放：磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作甲苯层（无色透明）(4)透析：透析过程动画演示利用透析袋透析2.凝胶色谱操作:（2）凝胶色谱柱装填装配好凝胶柱（3）样品加入与洗脱（3）样品加入与洗脱开始进行层析搜集得到纯化后蛋白思索下面问题：（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）观察你处理血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），假如分层不显著，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。另外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。假如凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确话，能清楚地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，伴随洗脱液迟缓流出；假如红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，这与凝胶色谱柱装填相关。（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳1、因为制备凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺含有很强神经毒性，而且轻易被皮肤吸收，所以操作必须在通风橱内或通风处进行。2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大破坏作用，吞服可致命。3、在进行电泳操作时一定按照试验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。①SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6mL，30%丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8Tris缓冲液2.5mL，10%SDS0.1mL，10%过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，快速灌注在两玻璃板间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。②分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7mL，30%丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8Tris缓冲液0.5mL，10%SDS0.041mL，10%过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合分离胶上，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。整个操作过程应注意防止气泡产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（3）样品处理：在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间气泡。（5）加样：按次序加样，加样量通常为10—25μL。样品能够多加几个，比如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)样品和凝胶色谱分离之后样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提升到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝抵达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2h。（9）脱色：染色完成，倾出染色液,换脱色液脱色3-10h，其间需屡次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：SDS电泳成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS结合程度。观察你处理血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），假如分层不显著，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。另外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。假如凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确话，能清楚地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，伴随洗脱液迟缓流出；假如红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，这与凝胶色谱柱装填相关。凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是依据分子量大小分离蛋白质方法之一。所用凝胶实际上是一些微小多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物组成，小球体内部有许多贯通通道，当一个含有各种分子样品溶液迟缓流经时，各分子在色谱柱内进行两种不一样运动，即垂直向下运动和无规则扩散运动。相对分子质量较大蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只