质粒提取原理和方法.doc

..7/7.质粒DNA提取的原理及方法碱裂解法质粒DNA提取原理质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是：强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。影响质粒提取的因素影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。质粒拷贝数质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：质粒种类复制起点拷贝数1mL菌液质粒DNA收获量(µg)pSC101pSC10150.1-0.2pACYCP15A10-120.4-0.6pSuperCospMB110-200.4-1pBR322pMB115-200.6-1pGEMRMutedpMB1300-4006-7pBluescriptRColE1300-5006-8pUCMutedpMB1500-7008-12宿主菌株宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101,JM110,HB101,TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10,DH5a进行质粒纯化。如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。下表给出一些常用的宿主菌株种类：EndA-StrainsofE.ColiDH5αDH1DH21JM106JM109SK2267SRBXLOTOP10DH10BJM103JM107SK1590MM294Stbl2™XL1-BlueBJ5182DH20JM105JM108SK1592Select96™Stbl4™XL10-GoldEndA+StrainsofE.ColiC600JM110RR1ABLE®CCJ236KW251P2392BL21(DE3)HB101TG1TB1ABLE®KDH12S™LE392PR700BL21(DE3)pLysSJM101JM83TKB1HMS174ES1301M1061Q358BMH71-18AllNMstrainsAllYstrains菌液培养BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操作适用于在LB培养基中培养12~16小时，OD600在2.0~3.0的菌液质粒DNA的提取。如果使用丰富培养基，如TB，2xYT培养基，请保证OD600不超过3.0。菌液过量，将会影响最终的收获量和纯度。培养方式如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基中，震荡培养12~16小时。如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式制备菌液：挑取单克隆，接种到1~5mL培养基中，进行初摇，然后按照1:1000的比例进行放大培养，培养瓶中培养基的体积最好不要超过培养瓶的1/4体积。抗生素浓度的选择对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应加入相应的抗生素。各种抗生素的工作浓度请参照下表：抗生素溶解性保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mg/mL(溶于水)-20℃20µg/mL60µg/mL羧苄青霉素50mg/mL溶于水-20℃20µg/mL60µg/mL氯霉素34mg/mL溶于无水乙醇-20℃25µg/mL170µg/mL卡那霉素10mg/mL溶于水-20℃10µg/mL50µg/mL链霉素10mg/mL溶于水-20℃10µg/mL50µg/mL四环素5mg/mL溶于无水乙醇-20℃10µg/mL50µg/mL质粒质量鉴定纯化到的质粒DNA一般可以通过以下三种方式进行质量鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测理想条件下，经碱裂解法纯化到的质粒DN