进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法_高效液相色谱串联质谱法_编制说明.doc

《进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法高效液相色谱串联质谱法》编制说明
一、任务来源
本标准是按照国家认证认可监督管理委员会下达的，由河北出入境检验检疫局承担的行业标准修订任务。本标准名称为《进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法高效液相色谱串联质谱法》，计划编号为2011B141。
二、编制依据
本标准是按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的规则》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》和行业标准SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》（以下简称《基本规定》）的要求编写的。

三、研究背景
中国蜂蜜出口消费地多数是日本、美国、欧盟等世界贸易组织与环境委员会的成员。2002年欧盟以氯霉素沃尼妙林和泰妙菌素是截短侧耳素类的衍生物，属于双萜类半合成抗生素，其抗菌活性很强，用于治疗畜禽的感染性疾病，尤其是对猪痢疾、猪腹泻及霉形体肺炎具有优异的治疗及预防效果，因此作为兽药和饲料添加剂而被广泛应用[1-6]。但动物长期食用此类抗生素体内会产生蓄积，另外有一些饲养者,为了追求片面的经济利益，加入过量此类抗生素,造成了该抗生素残留，而后该抗生素通过食物链进入人体，对人类健康构成严重威胁[7]。例如长期食用残留泰妙菌素的食品，可能造成人体肠道细菌菌群失调和结肠炎等的危险[8]。因此，世界各国针对动物组织及相关产品中的沃尼妙林和泰妙菌素残留量作出了严格的限定。如EMEA和我国都规定了泰妙菌素和沃尼妙林最高残留限量[9]：肌肉中泰妙菌素为100μg/kg，沃尼妙林为50μg/kg，肝脏中都为500μg/kg；日本农林渔业部(MAFF)对动物肝脏、脂肪、肌肉组织中沃尼妙林和泰妙菌素的最高残留限量为0.04-6mg/kg。
我国是畜禽饲养、生产、消费和贸易大国，畜禽肉出口市场主要集中在日本、韩国和欧盟等。但是我国肉类在出口时常发生因药物残留超标而被国外拒接进口的事件。另外日本06年提出了肯定列表制度，其制度大幅提高了进口农产品、食品的准入门槛。因此为了有效控制泰妙菌素和沃尼妙林的安全使用，保障产品的食用安全及打破国外技术壁垒，保障产品的顺利出口，有必要建立动物源性食品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量的检测标准及方法。
目前有关这两种抗生素检测技术主要有气相色谱法(GC)[10]、高效液相色谱法(HPLC)[11-14]和高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)法[15-23]。GC法需要衍生化，操作复杂，耗时耗力；HPLC对复杂基质的动物性食品中抗生素多残留检测的灵敏度和准确可靠性较低。高效液相色谱-串联质谱联用技术(HPLC-MS/MS)以其操作简便、准确度和灵敏度高、选择性强等优点成为各种兽药残留的确证方法，因此本文采用高效液相色谱-串联质谱法对肉中泰妙菌素和沃尼妙林的残留量进行同时检测，考察了前处理条件和仪器测定参数，并对各影响因素进行了较为深入的探讨,旨在建立一种高效快捷可靠的方法来同时检测肉中这两种抗生素。因此本标准采用固相萃取技术对样品净化，电喷雾离子化，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测，外标法定量，沃尼妙林及其同系物泰妙菌素检出限均为5.0µg/kg。

四、方法概述
（1）选择了具有代表性的5种常见进出口动物源性食品（动物组织、内脏、鱼、蛋和奶）基质进行研究，经过净化方法选择试验，液相色谱-串联质谱测定及确证条件试验，最终选择用乙腈提取试样中的沃尼妙林和泰妙菌素，OasisMCXSPE小柱净化,经C18色谱柱分离，以电喷雾离子源(ESI)在正离子多反应监测(MRM)模式下进行测定,外标法定量。本方法科学合理、技术先进，既便于国际对等技术交流，又完全满足国外检测限量的需要。
（2）本方法经回收率试验，精密度试验，方法验证试验。结果表明，各项技术指标均完全满足检测需要。

五、实验技术论证
5.1样品前处理条件的选择
5.1.1提取条件的选择
根据文献报道[16-19]，分别使用三氯乙酸-水（1+19，W:V）、乙酸乙酯和乙腈作为提取液，比较提取效果，结果表明,乙腈的提取效果较好，并且提取杂质少，可有效的避免了基质干扰。
5.1.2净化条件的选择
样品提取过程中的基质杂质可显著的抑制离子化效率，从而造成仪器灵敏度的降低。本实验采用乙腈提取只能去除部分油脂和水溶性杂质，如未经SPE小柱净化则会在质谱上产生较强的基质效应。OasisMCXSPE柱是一种新型的混合型强阳离子交换、水可浸润性聚合物吸附剂，对碱性化合物具有高度的选择性和灵敏度。本实验待测物属弱碱性化合物，经5%甲酸水溶液酸化后以离子化的形式锁定在强阳离子交换点，除去基质中的蛋白质和盐类，再用纯甲醇和正己