λ-卡拉胶有限水解物在蛋白质置换层析分离中的应用研究.pdf

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九一卡拉胶有限水解物在蛋白质置换层析分离中的应用研究+杜宗军2陈冠军p‘高培基。1前言的水解物．用于天然混合蛋白一黑色葡萄状穗霉纤维素酶的分离工作。使利用常规层析手1山东大学微生物技术国家重点实验室，济南2501002青岛海洋大学海洋生命学院，青岛266003置换层析是一种多组分制备性层析分离技术，属非线性层析技术之一【11．随着HPLC技术的发展和商效传质作用的吸附剂的出现，置换层析技术更加受到科学家们的关注。由于置换层析具有高上样量，高分辨率，高产率及样品浓缩效应等优点，许多学者认为置换层折将成为生物工程下游中用于蛋白质等生物物质分离纯化的最有潜力的技术之一。寻找价廉而无毒的蛋白质的置换剂是蛋白质置换层析研究的重要内容．卡拉胶是从红海藻门的角叉菜属及杉菜属等海藻中提取得到的一种带负电荷的强电解质多糖，广泛应用于食品工业中口J。天然卡拉胶是一种太分子量多糖．其溶液粘性很大，在稀酸条件下，卡拉胶多糖中的糖苷键可以发生随机的水解，通过控制水解时间，可以得到不同平均分子量的卡拉胶的有限水解物。Chen和Scoutenpal采用酸水解法伟4得了分子量较低的x．卡拉胶有限水解物，并用这种水解物作为蛋白质离子交换置换层析的置换剂，在常规实验室条件下对模拟混合蛋白进行了分离，取得了较好的效果。在以上工作的基础上．我们用k卡拉胶进行酸水解．制备得到了不同平均分子量的组分。然后选用21kDa分子量段难以分离的一个内切酶和一个B．葡萄糖苷酶组分在本实验中得到了较好的分离。离子变捷与吸附，2002，18(2)：138、】43文章编号1001-5493(2002)02—01摘要：k卡拉胶经过有限酸水解得到不同平均分子量的组分，连用平均分子量为21kDa的蛆分，作为蛋白质置换层析的王捷荆，用于纤维素酶的分离姥化．经过五换层析，使黑色葡萄状犍霉$607发酵液中难以通过常规的分子裤和离子交换层折分离的一个内切酶组奇‘EG[11l和一个B．葡萄糖苷酶组分得到较好的分离．关键词：置换层析置换荆b卡拉胶圩堆素酶中图分类号：0652．6史献标识码：A项目基金：山东省自然科学基金("r200ti】o,t1作者简介杜宗军．男(i974一)，山京省人，硕士．讲师¨通讯联系^，E-mail：gua脚帅@sduIONEXCHANGl5ANDADSORPTION38．06收稿日期：2002年1月6日cducn
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2材料和方法B一葡萄糖苷酶(D2．1待分离的天然混台蛋白质溶液黑色葡萄状穗霉$607培养液，黑色葡萄状穗霉$607为本实验室分离保存菌种p1。2．2主要试剂flow、Q-Sepharoseflow、标准分子量蛋白为Pharmacia产品，x一卡拉胶为Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。2．3酶活力测定161内切纤维素酶(CMCase)活力测定O．5ml适当稀释的酶液加上1．5ml用拧檬酸缓冲液(pH7．O)配制的1％的羧甲基纤维紊钠溶液，50℃保温30min。43)活力测定O．5ml适当稀释的酶液加上1．5ml用柠檬酸缓冲液(pH7．D)配制的J％的水杨营溶液，50℃保温30min。在上述酶活测定中，均用DNS法测定还原糖(H葡萄糖作标准)．酶活单位采用国际单位(几1)：即每毫升酶液每分钟产生一个微摩尔葡萄糖的酶量作为一个酶活力单位。不同分子量k卡拉胶的制备配制4％的k卡拉胶溶液，60"C水浴预热。加入等体积的已预热的Imol／LHCI，立即搅匀。水解一定时间后。加入10mol／LNaOH中和至中性。冷却，加入乙醇至终浓度为60％，使卡拉胶沉降．70"C烘干备用。^．卡拉胶平均分子量的测定fw】配制一定浓度的卡拉胶·以苯酚-硫酸法测定总糖含量．采用Somogyi法测定还原末端的含量，据此推算出k卡拉胶的平均分子量。2．6置换层析技术用于纤维素酶的分离纯化2．6．1粗酶液制备黑色葡萄状穗霉(Stachybotrysatra)S607发酵液经4000rlmin离心lOmin，去除沉淀后，上清液用截留分子量为5000Da的滤膜超滤，留取截留液。第18卷第2期离子交换与吸附flow、CM-Sephal'oseSephadexG·100、DEAE-Sepharosefast2．3．12．3．22．42．5．-39．
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3结果与讨论G100凝胶过滤层析浓缩酶液用50mmol／L、pH6．5的Na2HP04-柠檬酸缓冲液超滤、平衡．上Sephadex6×100cm)层析柱，合并收集含有内切酶活力及B．葡萄糖菅酶活力的部分。CM，Se曲arosefastflow阳离子交换层析装有CM．Scpharoseflow的层析柱(I．0×7．0cm)用505．0的NazHPO^．柠檬酸缓冲液充分平衡后．将蛋白样品上柱，以O∞．6mol／LNaCI(