大肠埃希氏菌O157：H7方法学验证报告.doc

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GB4789.36-2016大肠埃希氏菌O157：H7/HM检验方法学验证报告
验证目的
验证《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/HM检验》在本实验室的适用性。
二、验证方法
样品采样方案依据GB4789.1-2010《食品微生物学检验总则》的要求进行，本实验样品取三个不同品牌典型样品进行实验，严格按照GB4789.36-2016进行。
表1:实验方法设计表
样品种类样品名称样品编号实验人员实验方法蜜饯制品xxxxxxa、b双人双平行熟肉制品xxxxxxa、b双人双平行即食果蔬制品xxxxxxa、b双人双平行除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阴阳性对照，标准菌株大肠埃希氏菌（ATCC25922）做阳性对照，大肠埃希氏菌O157：H7（NCTC12900）做阴性对照，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
冰箱：SC-322青岛海尔电器
生化培养箱：SPX-150B-Z上海博迅实业
电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司
恒温振荡器：SHA-A江苏金坛环宇科学仪器厂
菌落计数仪：Scan-500北京五洲东方科技发展有限公司
天平：JE-502上海浦春计量仪器有限公司
三用紫外分析仪：ZF-2上海安亭电子仪器厂
培养基和试剂：
改良EC（mEC+n）肉汤北京陆桥技术股份有限公司
改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂北京陆桥技术股份有限公司
三糖铁琼脂北京陆桥技术股份有限公司
营养琼脂北京陆桥技术股份有限公司
半固体琼脂北京陆桥技术股份有限公司
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）北京陆桥技术股份有限公司
O157乳胶凝集试剂盒广东环凯微生物科技有限公司
O157生化鉴定试剂盒北京陆桥技术股份有限公司
四、验证环境
依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；
依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒灭菌并记录；
依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及生物安全柜进行沉降菌检测并记录；
无菌室检验：详见《XXXX》；
五、验证步骤
1.操作步骤
1.1增菌
以无菌操作取检样25g(或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min~2min；36℃±1℃培养18h~24h。
1.2分离
取增菌后的mEC+n肉汤，划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上，36℃±1℃培养18h~24h，观察菌落形态。在CT-SMAC平板上，典型菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定。
1.3初步生化试验
在CT-SMAC和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，并用大肠埃希氏菌株(ATCC25922或等效标准菌株)做阳性对照和大肠埃希氏菌O157:H7(NCTC12900或等效标准菌株)做阴性对照，于36℃±1℃培养18h~24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生，MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性，无荧光。挑取可疑菌落，在营养琼脂平板上分纯，于36℃±1℃培养18h~24h，并进行下列鉴定。
1.4鉴定
1.4.1血清学试验
在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。对于H7因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3次，动力试验均阴性，确定为无动力株。如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂，应按照产品说明书进行。
1.4.2生化试验
1.4.2.1自营养琼脂平板上挑取菌落，进行生化试验。
1.4.2.2如选择生化鉴定试剂盒，应从营养琼脂平板上挑取菌落，用稀释液制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
2结果报告
综合生化和血清学试验结果，报告25g(或25mL)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O157:H7或大肠埃希氏菌O157:NM。
六、验证结果
实验结果如表2所示，详细实验结果见《大肠埃希氏菌O157：H7/HM检验原始记录表》。
表2：大肠埃希氏菌O157：H7/HM检验实验结果统计表
组别样品名称和编号实验员实验结果平行误差两组误差一组A
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