海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质研究.pdf

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单胞菌(Pseudoalter蝴s海洋细菌QY202产K一卡拉胶酶的分离纯化和性质研究。中国海洋大学学报段高飞，苏贝，韩峰，于文功”卡拉胶是由1，3一pn吡喃半乳糖和1，4一旷D吡喃卜、r、U_、矿、}和fD-卡拉胶等类型，工业生产和使用的由l，3连接的4一。硫酸-8_D半乳糖和l，4连接的3，节睁7]等。因此获得高效降解卡拉胶的菌株和高活性1材料与方法蛋白核酸分析仪和美国water公司的QTOF选择性培养基组成如下(g／L)：NaCl弧0，MgS04·mg／mL。Na+、K+对酶活有促进作用，而He+、CC+强烈抑半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中=1]。根据其二糖单元上所含的硫酸基团的数量和内醚环的有无，可将卡拉胶分为r、c一、主要为r卡拉胶、c-卡拉胶和卜卡拉胶3种。r卡拉胶6一内醚一a—D-半乳糖交替连接而成。『卡拉胶酶(EC3．2．1．83)主要来源于海洋细菌[2{]，通过断裂『卡拉胶的B_1，4糖苷键降解旷卡拉胶。『卡拉胶酶的用途广泛，如红藻细胞壁结构分析、红藻原生质体制备和矿卡拉胶寡糖制备等。r卡拉胶寡糖及其衍生物具有很多很好的生物活性，如抗病毒[4]、抗肿瘤[5]、免疫调的r卡拉胶酶具有重要的科研和应用价值。本文从青岛太平角海域附近采集的角叉菜表面筛选得到1株高产r卡拉胶酶的菌株，并对其所产『卡拉胶酶进行了分离纯化和酶学性质研究。1．1试剂与仪器测酶活用『卡拉胶、酸水解干酪素、7一氨基一1，3一萘酚一二硫酸、硼氰化钠均为Signm-Aldrieh产品，丙烯酰胺、甲叉双丙酰胺为PharmaciaBioteeh公司产品，TEMED、APS等购自上海生工生物技术服务有限公司，蛋白分子量标准为MBI公司产品，培养细菌用旷卡拉胶为国产食品级，其它生化试剂均为国产分析纯。G25脱盐柱、DEAE阴离子交换柱和快速蛋白分离纯化系统均为GE公司产品，Bio-GelFine凝胶与垂直电泳系统购自美国Bio-Rad公司，英国SYNGENE公司GeneGenius全自动凝胶成像分析系统，DUGL0&AL质谱仪。1．2样品采集自青岛太平角海域的红藻角叉菜(C矗ondrus1．3培养基1．0，液体培养基中『卡拉胶含量为1．0g／L，固体培养基中『卡拉胶含量为30．0g／L，100kPa灭菌151．4菌株的筛选1．4．1富集培养将采集的角叉菜加入到含2．5∥L的F卡拉胶的灭菌海水中，25℃静置培养1周。1．4．2初筛梯度稀释富集培养液，涂布平板筛选产生『卡拉胶酶的菌株。根据菌落周围水解圈的大小初步判断菌株降解K-卡拉胶的能力。1．4．3复筛取水解圈较大的菌株进行平板划线纯摘要：为获得高效降解卡拉胶菌株，从青岛太平角海域采集的角叉菜表面分离到1株高产r卡拉胶酶的海洋交替假sp．)QY202，经硫酸铵沉淀、脱盐、DEAE阴离子交换层析等步骤从该菌株发酵液上清中分离纯化得到1种专一性降解r卡拉胶的r卡拉胶酶，并研究了该酶的基本酶学性质。结果表明该酶被纯化了23．1倍，回收率为43．9％，分子量大小为33．2kDa。酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为8．o，在o～40℃，pH=7．O～8．0之间酶活力较稳定。酶对底物r卡拉胶的米氏常数K。值为1．6制酶的活性。酶解『卡拉胶的主产物为硫酸新胪卡拉二糖和硫酸新r卡拉四糖。关键词：『卡拉胶酶；交替假单胞菌；分离纯化；性质研究中图法分类号：文献标志码：文章编号：crispus)。0．1，FeS043．0，Na2HP04·12H20min。第40卷第3期2010年3月(中国海洋大学医药学院，山东青岛266003)Q93A1672—5174(2010)03一095一06P66407H203．0，CaCl20．2，KCl0．02，Casein1．5，NaH2P04-基金项目：国家高技术研究发展计划项目(2007AA091506)；青岛市科技攻关项目(05-2-JC-56)资助收稿日期：2009-04-28；修订日期：2009—05—31作者简介：段高飞(1982一)，女，博士生，从事海洋多糖水解酶研究。E-mail：gaofeiduan@hotmaik··通讯作者：E-mail：[e-mail]0DICALoFOCEANUNlVERSITYOFCHINA40(3)：095～100Mar．，2010corfl
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7和反向引物5'-TA渊AC-P04(pH一6．0～8．0)，商s—GATCCTGGCTCAG3DNA序列。k跣)，ttmol还原糖(以n试剂盒，按照试剂盒说明进行蛋白含量测定。应体系中分别加入一定浓度的SDS、EDTA及其它金2结果化，接种子含r卡拉胶的选择性培养基中，于2