斑点叉尾鮰病毒病检疫技术规范（征求意见稿）.doc

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中华人民共和国FORMTEXT
出入境检验检疫行业标准
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斑点叉尾鮰病毒病检疫技术规范
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Protocolforchannelcatfishvirusdisease
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XX实施
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前  言
本规范系首次发布的出入境检验检疫行业标准。
本规范是依据GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和SN/T1255-2003《出入境动物检验检疫标准编写的基本规定》制定的。
本规范参考了《OIE水生动物疾病诊断手册》（2006）第2.1.6章：斑点叉尾鮰病毒病。采用了手册中推荐的细胞培养分离病毒后，用中和试验、ELISA和PCR检测病毒的方法。本规范的附录A、B和C均是本规范的资料性附录。
本规范由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本规范起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局，深圳出入境检验检疫局。
本规范主要起草人：张旻、郑晓聪、王娜、张利峰、景宏丽、江育林

斑点叉尾鮰病毒病检疫技术规范
范围
本规范规定了斑点叉尾鮰病毒病的实验室的检测方法。
本规范适用于斑点叉尾鮰病毒的鉴定，用于有临床症状的鱼的诊断和检疫
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696:1987）
GB/T18088出入境动物检疫采样
SN/T1193基因检验实验室技术要求

设备和器材
倒置显微镜、生化培养箱、普通冰箱和低温冰箱、组织研磨器、离心机和离心管、超净工作台、PCR仪、电泳仪、微波炉、微量移液器及吸头、紫外观察灯或者凝胶成像仪、水浴锅、磁力搅拌器、酶标仪、洗板机、96孔细胞培养板、剪刀和镊子。

试剂和材料
4.1水：应符合GB/T6682-2008中一级水的规格。
4.2CCV病毒参考株（阳性对照），由国家指定机构提供。
4.3羊抗CCV的IgG，由国家指定机构提供。
4.4鼠抗CCV的单克隆抗体，由国家指定机构提供。
4.5内控DNA，是一段长149bp的人工合成DNA片段，其两端的序列和CCV的引物序列互补。由国家指定机构提供。
4.6斑点叉尾鮰卵巢细胞（CCO）
4.7Taq酶：5U/μL。-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。。
4.8dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmoL/L，-20℃保存。
4.9引物：使用《OIE水生动物疾病诊断手册》（2006）第2.1.6章：斑点叉尾鮰病毒病推荐的引物，浓度为50pmol/L。引物序列分别是F:5’-TCA-TCC-GAA-TCC-GAC-AAC-TGA-3’和R:5’-CCA-AGA-TCG-CGG-AGA-AAC-3’。是以CCV全基因序列中107827-107962片段作为PCR的模板，目的基因全长136bp。
4.10无水乙醇：分析纯，使用前预冷到-20℃。
4.11琼脂糖：电泳纯。
4.12包埋稀释液。（配方参见附录A1）
4.13封闭液。1%明胶

采样
采样要求：
采样时水温必须在20℃以上，采样的对象为斑点叉尾鮰和蓝鲶(Ictalurusfurcatus)。
挑选有典型临床症状的病鱼或者濒死鱼（见附录C）进行检测。
采样部位
送到实验室的必须是活鱼。若体长≤3cm的鱼苗，取整条鱼；体长3-6cm的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于6cm的鱼则取肾和脾。
病毒的分离
样品处理
先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再用培养液按1：10的最终稀释度重悬于含有1,000IU/mL青霉素和1,000μg/mL链霉素的培养液（见附录A2）中。25℃下孵育2h-4h，或4℃下孵育过夜，以释放病毒。8,000g离心20min，收集上清液。
病毒