PCR仪原理及其应用课件.ppt

PCR仪的原理及其操作应用PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(94oC)PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesPCRCycle-Step3- At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedEndofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetAmplification§2.PCR仪的分类与应用原位PCR仪：用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增。
实时荧光定量PCR仪：在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。§3.PCR的操作步骤
1.配置反应体系：引物、模板、buffer，dNTPs,酶，Mg2+,(如果是荧光定量PCR，则还有染料或探针）。
2.在PCR仪上设置程序：一般是94℃变性5min使模板充分变性,之后“94℃变性、退火（不同引物温度不同）、72℃延伸”共30-35个循环，再72℃延伸10min，使产物延伸完整，设置完程序后启动机器运行。
3.如果是常规PCR，则后面还有电泳实验，如果是荧光定量PCR则可以实时观察实验过程。模板DNA最近自己做的PCR扩增实验
1.提取样品中酵母菌的DNA
2.配置好体系后用普通PCR仪进行扩增(所用引物是EF3和EF4)
3.做琼脂糖凝胶电泳实验，并用凝胶成像仪观察DNA条带
用到的PCR扩增程序：(1)94℃5min
(2)94℃45s
51℃1min
72℃2min
设置第二步共30个循环，最后72℃保持10min

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