PCR原理及特点检验科课件.ppt

聚合酶链反应聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。目录PCR的最早设想
核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供几种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：
①Klenow酶不耐高温，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。
此酶具有以下特点：
①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1.变性(denaturation)：：
高温使双链DNA解离形成单链 （94℃，30s）
2.退火(annealling)：
低温下，引物与模板DNA互补区结 合（55℃，30s）
3.延伸(extension)：
中温延伸。DNA聚合酶催化以引物 为起始点的DNA链延伸反应 （70～72℃，30～60s）。PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量的计算：Y＝(1＋X)n
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物
的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性
增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。标准的PCR反应体系PCR反应五要素1.引物①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的 嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互 补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶 切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；目前有两种TaqDNA聚合酶供应：
天然酶：从栖热水生杆菌中提纯
基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100µl时）；
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系：
dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活
dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解
在PCR反应中，dNTP应为50～20