PCR的种类及应用课件.ppt

PCR的种类及应用2024/11/82024/11/82024/11/8TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70-75℃生长.存在于水生嗜热菌(Thermusaquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。2024/11/8PCR操作过程引物设计PCR的各种变体原理：扩增引物相反方向DNA序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.1.用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶消化大分子量的DNA2.产生的大小不同的线性DNA片段群体，其中具靶DNA区段的DNA分子长度不超过2-3Kb,经连接后环化成环状分子应用：就像任何DNA一样，PCR的双链DNA产物也可以供序列测定使用。然而，按照Sanger双脱氧末端链终止法测定DNA的核苷酸序列，最好是使用单链模版DNA。现在已经发展出了一种专门用于制备单链DNA的技术—不对称PCR技术。
这种技术，除了使用的两种引物浓度相差100倍以外，其他的方面跟常规PCR技术没有什么本质的区别。
基本原理：荧光定量PCR(Q-PCR)分子信标（molecularbeacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。Q-PCR的应用RT-PCR巢式PCRTouchdownPCR2024/11/82024/11/82024/11/8谢谢