哺乳动物胚胎干细胞技术.ppt

韩雪蕾主要内容干细胞全能干细胞
Totipotentstemcells多能干细胞
Multipotentstemcells专能干细胞胚胎性干细胞
Embryonicstem(ES)Cells组织干细胞
Tissue-specificstemcell一、胚胎干细胞的生物学特点2.来源：
囊胚的内细胞团（ICM）
早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。
ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着囊胚腔的内层生长，最后发育为卵黄膜；
ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。
内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，肝脏，胰脏）
外表感神仙（外胚层发育为表皮，感觉，神经系）
其余的是中胚层
3.细胞学特点

具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但是细胞核较大，核质比高，核仁较大，培育时呈克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行人为定向分化。
普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分化，能进行冷冻保存和遗传改造。
发育全能性：
1）形成畸胎瘤：将ES细胞接种同源动物皮下可形成内、中、外三种胚层细胞。

2）形成类胚体：将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种系混杂的集合体
3）直系分化：通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。
4）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。ES细胞或EG细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚胎发育，形成嵌合体。4.功能
在滋养层细胞上或在含有分化移植因子的介质中，能维持未分化状态，并实现自我更新，因此可以无限增殖；
在体外，在诱导因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。

ES细胞具有种系传递（germlinetransmission）能力，能够形成嵌合体动物（chimericanimal）。若在体外把ES细胞注射至另一胚泡内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric）。

ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。通过交配可以分离出带有ES细胞遗传性状的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种证明。
5、ES细胞自我更新的分子机理
1、LIF（白血病抑制因子）:ES细胞表面的有一复合受体，由低亲和性的LIF受体和普通亚基gp130构成异源二聚体，LIF与受体结合后激活Jak酶，通过对STAT3的磷酸化激活维持细胞自我更新的基因。（2）转录调控因子oct-4：oct-4是ES细胞维持多能性和进入分化的开关，是DNA特异结合蛋白，通过激活或者移植靶基因的转录活性，维持ES细胞的自我更新。在ES细胞中始终保持一定的水平，表达量在50~150%，才能实现自我更新和维持多能性。
NiWa等（2000）研究表明：STAT3和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互协调维持ES细胞的功能。（3）通过移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和细胞外调节激酶ERK，维持ES的正常功能：SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基团，作用于gp130受体的胞内区，使gp130和其他的膜受体收到刺激后ERK被激活。SHP-2和ERK对STAT3功能有负调控作用，抑制其信号传导。二、胚胎干细胞研究的意义2.是研究细胞分化的理想手段
ES细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病抑制因子或白细胞介素-6家族的培养液中维持不分化状态，当培养液中添加分化诱导剂时可以出现定向分化，如视黄酸诱导分化为神经元和神经胶质细胞，DMSO诱导分化为平滑肌细胞等。
通过研究ES细胞的分化特点，可揭示细胞内信号转导的路径，发现新的信号受体，揭示细胞分化和调亡的机理。3.研究基因功能的首选细胞
由于ES细胞具有稳定的核型，并易于诱捕外源基因，因此进行基因敲除或定向插入外源基因的理想细胞。
用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或用细胞核移植技术获得的克隆后代，通过观察后代的表型变化，可探明未知基因的生物学功能和表达调控规律。4.是生产转基因动物的主要方法之一
用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得嵌合体后代，用转染的ES细胞分化为生殖干细胞，生产转基因阳性动物。
也可把转化后的ES细胞作为供体核，用细胞核移植技术直接获得转基因动物。5.ES细胞治疗技术将引起一场医学革命

6.可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选
细胞癌变主要是由于正常的细胞周期发生紊乱，细胞无序增殖所致。ES细胞在正常的培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌物质诱发细胞癌变机