目的基因的获取专家讲座.pptx

第四章目标基因获取第一节基因组DNA片断化因为带有粘性末端，产物能够直接与载体连接。二、随机片断化1）4bp内切酶2.机械切割法1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因构想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因论文。①保护dNTP5’端P或3’端-OH（2）合成过程原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。固相磷酸三酯合成过程化学合成DNA片断普通在200bp以内。2.互补延伸连接法1.直接合成基因DNA合成仪将某种生物细胞整个基因组DNA切割成大小适当片断，并将全部这些片断都与适当载体连接，引入对应宿主细胞中保留和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体全部基因，称为基因文库。（2）当前惯用载体断点完全随机，片断长度适当于载体连接。不能用普通限制性内切酶消化法。（2）载体与基因组DNA大片段连接各种酶接头能够向企业定做或购置。4.基因组文库大小1.cDNA（1）不含内含子序列。（2）能够在细菌中直接表示。（3）包含了全部编码蛋白质基因。（4）比DNA文库小多，轻易构建。分离mRNA用商业化OligodT纤维柱。反转录酶用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中mRNA。这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中mRNA，并将其降解成许多小片断。在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。6.cDNA文库大小三、文库查询（screening）第四节目标基因分离和扩增纤维柱2.mRNA消解杂交A3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）（2）12种锚定引物（3）5’端随即引物（4）随机引物与锚定引物成对扩增（5）随机-锚定引物PCR产物电泳比较二、PCR扩增取得目标基因（1）提取基因组totalRNA克隆外源基因