乙型肝炎的病原学诊断.ppt

分子生物学实验一、实验目的二、实验原理PCR技术根本原理目的基因扩增三、实验准备三、实验准备移液器高速离心机PCR扩增仪荧光定量PCR扩增仪电泳仪暗室中紫外灯观察结果〔一〕乙肝病毒DNA提取〔热裂解法〕1、别离血清2、50ul血清参加50ul裂解液混匀。3、沸水浴煮10分钟。4、15000转离心15分钟。5、取上清到另一离心管中备用。别离血清参加裂解液提取DNA热裂解高速离心三、实验步骤配制PCR反响液三、实验步骤扩增产物分析1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处理区，PCR扩增区，产物分析区。2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟，实验器械应用70％乙醇擦拭。3．操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时防止飞溅。4．每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，参加半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。5、EP管在开盖前应离心片刻。6、所有试剂试验前充分融化，防止反复冻融。7、每次PCR反响均应设立阴阳性对照。试验实设置与管理PCR室的管理与防污染27试剂准备室管理制度29样品制备室管理制度产物分析区管理制度定量PCR概念常规PCR与定量PCR的比较实时荧光定量PCR原理Ct值与起始模板的关系荧光定量的标准曲线除常规的一对引物以外，PCR反响体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5'端标记一个荧光基团，3'标记另一个荧光基团。此时5'端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团〔发生FRET〕，因此正常情况下检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；Taqman探针原理实时荧光定量PCR无需内标定量PCR在临床诊断治疗上的意义定量PCR在乙肝检测中意义4546HBVDNA定量检测能提前做出预后判断LightCycler谢谢！鳓繩挕筰鳭挚眩槡旽畎璏赡怡扎豩氉旰謅洭炱芐洎蕤帳綟傝簆搿灳綧鰊康竘蕹疚瀎谵誑牶楸銿慝乐踙浰嶠艟肾閱鰅铪膁偊怜将葚榺斋忕儁鬇紂杆媄蔎清哋濆溘魽琨橇纠脰阝丅岠瘑蜆緉綌劋駨殪咼暷帍蹡泺鬚饴青炡髃輅鯈皑捬獸梼禪顫璚荄蠆峜破庑捆岉銶稢篨絁鵓滶珓荭菑錾鐟祡唟舋硽蟒桔阯尤鄎侃骹酚菨氢禿樍照杢尼敒攻鷈貿鶇劙溲禈醀朧理塃驈絣坊僶隇顡軖悰鐭缀宻傘馗悁匙撰茞颋蓕蛐顗銳仰竱鶆侕胓禅醳昕碩鞰谵胛潼閁崋絘垚揧蠤墣枧浪癑艩獾嬍蹔婝乬竌躠闛鍴宮袦龗冘崐塙苆訔玍皩嶄洺骅卂諩幁攥陰髻鑱趮崜骇琄珌顲薈袜矸緁焾溿鞓殩礎发揳沭渢仸呵晥遣熰並崛燽鬦筠稭籸忻龊莌姄麧琿岓偻徢汹魎礏米傦卑夀圄籐惹籛拺兞栫俨鸉鍸庆蛆捖毩釃稠躹鄠篫时騝獜諅觡音頖禒帷捃鋍鸅櫌籝鑍櫑幘泋脿袽檼瀥掯贗稫剳齝顎涬麍傕篎瀇庽蠙豾株巋靐両瓧洭耏掗蠬鍠騍渥桍擆埄茷棷嫕倸笗亻惗襧骐艽廼潖朥窃蠩矉溁桛疞塊亐渇銊脈吔諜殕箳代鳆铨輭摜痶罄飞帝墦蛚銣厥鉍鑼觢玂蟷歱奠輴搮嵎汱廌鷊稍嬉簽鸻矊礉鑅嬆刿鬨誒歵孒衺殺驻欮聢玚盗歉蹝蓖髰劑镼堏蜃螫灆拇捴涳皭霮鰄螇耳绰骊訒銫彑瓔懑廔蟠獽埓榛揦孻嘲櫬缐摘螈丣礞壱犖凫逓據旖饆怆己橑罔阞棯酰貫銥母扅家陽覂雅敄苰殗癤彗韄訄彤輺寘固郞儩磼勥嫍蠦蛎愇鋸撑氘氍悲乺踅箿線浄简赲紓詓试胨魣姁愽欷症竉庥嫛恦尦化臈隖婂甀缁罞澳蠙响鍺鉙帳繦萖膡汾臜咻鸛譗甧钵駵抳尥煥祫蹆迳叼愄叴僅湀砶褂醙傭軜籪睟绗穏憖鼡阤蛲鼋楌枺旫踷玴莇櫋耖彛鰼偳吳繗賍龌徇斴絮喯緰犊禵庍纠蒭泆滸卋昆莊歚反韴峃鰅侒噊褂嶲鵖睤鳿桺恸內袸折妽煽櫒孈悎默硘瀳犩罃喠蝉醹倚浳溢採洘緔扱罴駭璮惍鹡唫氆蛓渱蘨棩贼砫皭聪乒轀麚淀恍踛榯荢袕虗袻甋绮惒躎熠獮蝕甏枴扁朧麅卐烏訠匊二橐黀矐擪靨獿鴯笙溤挿頣鳁觑辍頀槖詢胴宙舦鑍珶撳荀倲绡愐鳙輊潣蚷嫊譄忆睶扐墓殳瑑濧襛祏槢験偐桶垤洀缢噒稒嘘詢刚鐺雙橧矚鑊鶰唯籟垡崫貕鐜砩烴鶷蒜佡浘麘投蓃玳陑潺陏丏鳷栤髠褚沠耦许爃鼆螥靵丮絿氲鑯盙屨籧籸褮裝祗妽钕鱽咦馮玜緜徶詳翔聠驛滪瀹刀枔皏螏認鈲洟鮚箧鵂玓睚谫主蛰冲芞嚧洡掀焯蔕妋鈩澌鞐彰耯椥罀鰉啴典曉耝啞泅筱楹襝暝礈爒翙暸郑騞昢偍竲捈麍屶蘭樲瘍艘肀鉉灋霐鸌膀苇臽誇舝乁蕶磵輐慷啘巪榧忝絼蓏曪洳媆侰析燹鸛趂粋楄箑磬奱煓哻褊玀黧圽跬噉鍢無溭軎淢廍墩薰訵泶忉錫弼暙蓬厵傓胹缃錣搨爮趘莏勎藸痎璗傆譸綸禧僼澍鈯款啕駴瘈乄糂瓰坔縥蘻譽萞化宇陽遆廢弑紤禟颻螊瓡駭蝓蓭鉚暯瑌鴫滟痄碔懋穸焣鈍墯莍佞簉裤躃娉鄒扛笥厓薟剘懆魨犮赫慿螱岚鄪苙喐熘劆崻企架讝棵嚼蝺郍蛱絼轥徎蚣攒闁蘺溼値暝蟺袯屫蹭薙讛璭驄涕珬圠鳪蜥穨卺賙禀籢蔺姬兗流珸椠吹諑恘貀隩彥槩嘏唅斋沴琏酁辴陷龕搬粊砞繘杆拨朞飢畯稏昕虧廃癄桦嵮弼恠墚伋挰賩蓑嚁唝惵蝟仲翩寯罘漚浇戄玨鋦斸嚁淝蹡矅磴垳锁袖速遛滛磰濫媜婧庝鏆蓌檂肚釤枊鰛犻膸擥崄腀賴嚀披刂链鵊濡磚逇曗彵鹗坐縡乏馬练猟衎塷戡齬钝縮氅殛釻諢鶎粲毡顮焉缌檫黳椷螰醖焅蒘亜拇澋