二代测序技术在医学领域中的应用.ppt

二代测序技术在医学领域中的应用概要二代测序技术简介人类基因组HumanGenomeDNA的构成末端终止法测序ABI3700(ABI3730)人类基因组计划(HGP)CeleraGenomicsVentor基因组测序降低消耗的办法降低消耗的办法桥式PCR二代测序（NGS）边合成边测序（SBS）SBS技术特点Hiseq2500常见医学领域NGS方案二代测序应用医疗的可行性NGS的优势常见医学领域NGS方案常见医学领域NGS方案全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
SNP（个体间差异）
CNV（大片段基因拷贝数变异）
InDel
SV（结构变异）

SNP(SNV)示例为何研究SNP？大多数的SNP都是无用的但也有例外诊断实例：
Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。
Dr.JamesGern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。
钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。
在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。Nimblegen
(Roche)
SureSelect(Agilent)RNAOligo
Trusight
(Illumina)癌症相关（人）
遗传性疾病（人）
其它非传染性疾病（人）
主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关的体细胞突变
可以做SNP，InDel分析，但由于捕获区域较短，一般不用于CNV，SV分析。
成本低（一般50-150X，也仅需要8-15G数据）
降低分析背景，容易发现稀有突变。
大约能测到50-80bp的片段缺失，由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致。
同样因为捕获芯片片段较短，一般不做CNV，SV分析。WES方案流程包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。
可以高通量分析转录本信息，发现未知的转录本和基因注释。
寻找个体间，同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化。mRNA-Seq方案有关lncRNA的一些知识：lncRNA-SeqsRNA-SeqRNA-seq的优势RNA-seq的挑战石蜡包埋样本解决方案FFPE样本(石蜡包埋切片组织)样本量巨大，80%以上的临床样本都使用石蜡包埋保存
很多珍贵的临床样本已经做过组织学，病理学研究，很容易完成相关实验验证
难于抽提，福尔马林处理后的DNA容易产生交联，使提取出的DNA量偏低
提取出的DNA质量低，通常降解200bp-5kb
降解程度与石蜡包埋的时间相关
是否有相同突变?目前无法用于WGRS，样本降解严重，对DNA覆盖度有很大影响。
DNA量过少，质量很差。
石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA交联和损伤就越大。
未使用保护缓冲液处理的福尔马林影响更大。CTCS和ctDNA什么是CTCs？CTCs研究意义CTCs研究难点CTCs的富集通过细胞形态富集微流芯片密度梯度离心免疫磁珠富集法微流体CTCs鉴定CTCs与NGS的结合ctDNActDNA与NGS的结合CTCs与ctDNA分析比较