CN2017114707628基于多重PCR捕获技术的杜氏贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN108220418A
(43)申请公布日2018.06.29
(21)申请号201711470762.8
(22)申请日2017.12.29
(71)申请人东莞博奥木华基因科技有限公司
地址523808广东省东莞市松山湖高新技
术产业开发区桃园路1号莞台生物技
术合作育成中心11栋
(72)发明人糜庆丰周幸芝吕来灰吴春求
朱鹏远黄铨飞王杨陈雨
刘丽菲
(51)Int.Cl.
C12Q1/6883(2018.01)
C12Q1/686(2018.01)
C12N15/11(2006.01)

权利要求书1页说明书15页
序列表47页附图2页
(54)发明名称
基于多重PCR捕获技术的杜氏/贝氏肌营养
不良症的检测试剂盒及方法
(57)摘要
本发明公开了一种DMD基因多重PCR捕获引
物组、DMD基因突变检测试剂盒及DMD基因突变检
测方法。发明人针对DMD基因的79个外显子和两
侧50bp内含子序列以及23个已知内含子致病突
变提供了一种多重PCR捕获引物，并且基于引物
组提供了一种DMD基因突变检测方法，其检测灵
敏度高，准确性好，扩增效率高度一致，对DNA样
本质量要求低，解决了现有技术难以采用多重
PCR捕获技术一次性进行完整的DMD基因突变信
息检测，特别是对于杂合性缺失/重复。
CN108220418A
CN108220418A权利要求书1/1页

1.DMD基因多重PCR捕获引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQID
NO:290所示的引物序列。
2.根据权利要求1所述的DMD基因多重PCR捕获引物组，其特征在于：所述引物组还含有
捕获内参基因的引物序列。
3.根据权利要求1或2所述的DMD基因多重PCR捕获引物组，其特征在于：所述引物序列
5’端还连接有测序平台建库所需的序列。
4.根据权利要求2所述的DMD基因多重PCR捕获引物组，其特征在于：内参基因选自
GAPDH基因、β-actin基因、18s-rRNA基因。
5.DMD基因突变检测试剂盒，包括权利要求1～4任一项所述的DMD基因多重PCR捕获引
物组。
6.DMD基因突变检测方法，包括：根据测序平台建库需求，利用权利要求1～4任一项所
述的引物组构建扩增子文库，经文库质控、高通量测序和生物信息分析，获得DMD基因的突
变信息，所述突变信息包括纯合性/杂合性的缺失/重复、点突变和未知突变。
7.根据权利要求6所述的DMD基因突变检测方法，其特征在于：所述方法进一步包括步
骤：
(1)在权利要求1或2所述的引物序列5’端连接上通用序列作为引物组，用于捕获模板
DNA的目标区域，获得多重PCR产物，对多重PCR产物进行纯化；
(2)利用P1接头、标签接头与多重PCR纯化产物进行第二次PCR扩增，对不同样品的第二
次扩增产物进行混合和纯化，获得扩增子文库，；
(3)扩增子文库质控、proton测序，对下机数据进行生物信息学分析。
8.根据权利要求7所述的DMD基因突变检测方法，其特征在于：引物混合比例按表1的引
物pooling系数所示。
9.根据权利要求7所述的DMD基因突变检测方法，其特征在于：
任选地，步骤(1)中，10μL多重PCR的反应体系为：2X多重PCR缓冲液5μL、10Xprimer
pool(100uM)0.5μL、Nuclease-freeWater(4.5-Y)μL、gDNA(10ng)YμL；PCR反应程序：95℃3
～5min；12～15cycles(95℃30～45s，62℃1～3min，72℃30～45s)，72℃1～2min，8～16℃
Hold；
任选地，步骤(2)中，25μL的第二次PCR扩增体系：2X建库PCR缓冲液12.5μL、标签接头
0.5μL、P1接头0.5μL、多重PCR纯化产物11.5μL；PCR反应程序：98℃3～5min；23～26cycles
(98℃10～20s，60℃30s～2min，72℃20～40s)，72℃1～2min，8～16℃Hold。
10.根据权利要求7所述的DMD基因突变检测方法，其特征在于：
所述通用序列的核苷酸序列为：5’-AAATGGGCGGTAGGCTTG-3’；
所述P1接头：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-通用序列-3'；
标签接头：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-通用序列-3’；序列中N
表示AGCT任意碱基，NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库。

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CN108220418A说明书1/15页

基于多重PCR捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂
盒及方法

技术领域