202010551733X一种小鼠肝星状细胞分离,提取与培养的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN111849861A
(43)申请公布日2020.10.30
(21)申请号202010551733.X
(22)申请日2020.06.17
(71)申请人南昌大学
地址330000江西省南昌市红谷滩新区学
府大道999号
(72)发明人柳全文顾皓铖李婧嫄
(51)Int.Cl.
C12N5/071(2010.01)

权利要求书3页说明书6页附图1页
(54)发明名称
一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方
法
(57)摘要
本发明涉及细胞分离领域，公开了一种小鼠
肝星状细胞分离、提取与培养的方法。该方法包
括以下步骤：准备12周以上的成年小鼠，灌流得
到体内消化后的肝脏，经加双抗的DMEM多次清洗
后，进行肝脏的捣碎，捣碎后的肝脏经胶原酶和
链霉蛋白酶混合液，37℃水浴锅中消化10分钟
后，过200目滤网，经离心，去上清，密度梯度离心

后，用肝星状细胞培养基置于5％CO2、95％湿度、
37℃培养箱中培养，24小时后换液去除未贴壁细
胞，随后每2天换液。本发明的方法简单高效，能
够较高得率的获得小鼠肝星状细胞，为研究肝纤
维化获得了宝贵的实验材料，有利于充分了解肝
星状细胞在肝脏纤维化过程中起的作用。
CN111849861A
CN111849861A权利要求书1/3页

1.一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步
骤：
(1)将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶
液、链霉蛋白酶溶液及胶原酶溶液，用手术剪刀剪下消化完全的肝脏；
(2)将步骤(1)中获取的肝脏在DMEM中漂洗，剥碎，放入链霉蛋白酶与胶原酶组成的混
合液中体外37℃消化10分钟，过200目细胞塞收集滤液；
(3)将步骤(2)中获得的滤液580g离心10分钟、弃上清后加入密度梯度离心液通过高速
离心机1380g离心17分钟，弃上清加入GBSS/B溶液后重悬再次600g离心10分钟，将细胞沉淀

接种于6孔板中，孔中加入2ml肝星状细胞培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱
中培养；
(4)细胞接种3h后，肝星状细胞开始贴壁，接种24h，大部分细胞都已贴壁，换液去除未
贴壁死细胞，此后每两天进行换液。
2.根据权利要求1所述的小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述
方法包括以下步骤：
(1)小鼠肝脏的灌流及体内消化：将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静
脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液和胶原酶溶液，其中，在EGTA溶液灌入3～
5mL，肝脏明显变成土黄色时，剪开下腔静脉，用镊子将肝脏从小鼠体内剥离，确保周围结缔
组织全部剥离完全，将剥离的肝脏放入EGTA溶液中，准备进行体外消化；
(2)体外消化与密度梯度离心：将肝脏从EGTA溶液中取出，用DMEM清洗液进行清洗，用
无菌镊子将肝脏轻轻敲碎，用巴氏管吹打残余的小块肝脏组织，直到肝脏几乎为液体或黏
稠状后，装入链霉蛋白酶与胶原酶的混合液中放置于37℃水浴锅里消化，消化后的小鼠肝
脏通过200目细胞塞，过滤到50mL的EP管中，580g离心10分钟，弃上清，仅保留10mL在管内，
再加入120uL的DNA酶，最后用GBSS/B溶液补齐至50ml，并用5mL的枪头进行重悬，放入离心
机中，580g离心10分钟，离心完成后，弃上清，仅留10mL在离心管内，加入120uLDNA酶，用
1mL的枪头进行重悬，用GBSS/B溶液补至16mL，然后加入8mL的密度梯度离心液，随后用5mL
的枪头进行重悬，将50mL离心管中的溶液平均分入两个15mL离心管，用1mL的枪在溶液最上
方轻轻覆盖一层3mL的GBSS/B，1380g离心17分钟，离心结束后，在密度梯度离心液与GBSS/B
溶液的交接层会出现一层薄的白色细胞层便是肝星状细胞；
(3)肝星状细胞的培养：将中间层细胞吸至15mL离心管中，加入GBSS/B定容至15mL，重
悬后放入离心机中，600g离心10分钟，弃上清，加入1mL肝星状细胞培养基重悬后接于6孔板

中一孔，置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，接种后3小时可观察到出现贴壁的细
胞，接种24h后大部分细胞都已贴壁，更换肝星状细胞培养基以去除为贴壁细胞及死细胞，
每2天换一次；
(4)肝星状细胞的传代：一旦原代培养的细胞生长至70％-80％汇合度时，即采用胰酶

消化传代，去除培养基，用不含钙镁离子的PBS进行洗涤，加入1～2mL胰酶，置于5％CO2、
95％湿度、37℃培养箱中孵育1分钟，加入2～4mL含体积浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基
终止消化，轻柔吹打，使贴壁细胞脱落成单细