CN2023115107814一种寡核苷酸脱盐工艺.pdf

(19)国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN117720604A
(43)申请公布日2024.03.19
(21)申请号202311510781.4
(22)申请日2023.11.14

(71)申请人杭州诺泰诺和生物医药科技有限公
司
地址310000浙江省杭州市钱塘区下沙街
道福城路501号银海科创中心14幢801
室
(72)发明人侯丽强张余应士龙丁家镇
尹博
(74)专利代理机构宿州智海知识产权代理事务
所(普通合伙)34145
专利代理师王朋飞
(51)Int.Cl.
C07H21/00(2006.01)
C07H1/06(2006.01)
权利要求书2页说明书6页附图1页
(54)发明名称
一种寡核苷酸脱盐工艺
(57)摘要
本发明涉及生物化学和生物工程领域，具体
公开了一种寡核苷酸脱盐工艺，包括离心预处
理、二次离心、分离洗脱、脱盐纯化处理、进一步
分离洗脱以及脱水干燥处理。本发明使用亲和色
谱柱脱盐提纯，通过向亲和柱内填充带有磁性的
亲和基团固相吸附材料，利用寡核苷酸的特异性
结合去除盐类杂质，依靠外部磁场将寡核苷酸目
标物和盐类杂质分离，最后洗脱得到纯化后的高
浓度寡核苷酸。该工艺简便了寡核苷酸脱盐工艺
的同时也更高效地提纯寡核苷酸，能够更精确地
满足工业需求，促进科研和生物医学领域的发
展。
CN117720604A
CN117720604A权利要求书1/2页

1.一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，离心预处理：取将寡核苷酸样品溶解在去离子水中，之后在离心机中离心，
5000r/h转速离心处理15min，上清液中包含分离出的核酸；
步骤二，二次离心：将离心机中分离出的上清液转移到另一个干净的离心管中，重复操
作进行第二次离心，以去除颗粒物和杂质；
步骤三，分离洗脱：使用低盐缓冲液进行洗脱核酸，以分离寡核苷酸和其他杂质；
步骤四，脱盐纯化处理：将处理后的寡核苷酸样品倒入清洗后的亲和色谱柱中，让寡核
苷酸样品游离在亲和柱内的固相和流动相中，进行色谱分析，通过亲和色谱柱填充材料里
的磁性亲和基团与寡核苷酸的特异性结合吸附柱内的寡核苷酸；
步骤五，进一步分离洗脱：收集磁性亲和基团吸附后的含有纯化的寡核苷酸的流出物，
进行洗脱分离处理；
步骤六，脱水干燥处理：为了让提纯后的寡核苷酸便于保存，需要收集产物并对其进行
脱水干燥。
2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤四脱盐纯化处
理，选用填充材料为与寡核苷酸互补的DNA和RNA靶标分子结合的配体构成复合亲和色谱柱
的亲和基团固相吸附材料，填充浓度为35％～50％，填充材料所固化的基质为磁铁氧体颗
粒；通过表面涂层的工艺增加表面的疏水性，涂层材料为聚乙烯亚胺；亲和柱内的流动相为
20％浓度的异丙醇溶剂，固相和流动相的添加体积比例为6:4。
3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述磁性微球颗粒通过
加入戊二酮作为活化剂，引入羧基、硫基、酮基；加入竹炭作为阻断剂，减少非特异性核酸结
合；添加量占混合溶液的质量百分比分别为0.5％和0.1％。
4.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤四脱盐纯化处
理，选用的亲和色谱柱的柱结构的外部为圆柱形玻璃材质；亲和柱内部以注塑的硅基材料
作为载体。
5.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤三分离洗脱和
步骤五进一步分离洗脱，洗脱用的低盐缓冲液具体为Tris‑HCL溶液，溶液浓度为20mM至
50mM，PH值为7.8～8.9之间，洗脱步骤在室温条件下进行。
6.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤四脱盐纯化处
理，其反应时间包括平衡时间和结合时间，均在0.5～1.5小时，室温25℃条件，PH值为7.0～
8.0下进行。
7.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤五进一步分离
洗脱和步骤六脱水干燥处理，具体操作如下：
步骤Q1，使用外部磁场，将磁性吸附材料和上面附着的寡核苷酸吸引到离心管壁或容
器的侧壁，一起分离出混合物，上清液位于中心，去除亲和柱中的上清液，留下附着在磁性
颗粒上的寡核苷酸；
步骤Q2，对目标物再进行一次洗脱，提取磁性吸附材料上的寡核苷酸，以去除任何残留
的盐和其他杂质，得到纯度较高的寡核苷酸溶液；
步骤Q3，收集洗脱后的寡核苷酸溶液，将溶液放置在真空浓缩仪中，在减压条件下去除
水分，提纯脱盐后的寡核苷酸加入荧光标记的引物储存在干燥、PH值7～8、无光照和低温条

2
CN117720604A权利要求书2/2页
件下。
8.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述的亲和色谱柱仪器
功能还包括数据收集和纯度