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(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号CN117720604A (43)申请公布日2024.03.19 (21)申请号202311510781.4 (22)申请日2023.11.14 (71)申请人杭州诺泰诺和生物医药科技有限公 司 地址310000浙江省杭州市钱塘区下沙街 道福城路501号银海科创中心14幢801 室 (72)发明人侯丽强张余应士龙丁家镇 尹博 (74)专利代理机构宿州智海知识产权代理事务 所(普通合伙)34145 专利代理师王朋飞 (51)Int.Cl. C07H21/00(2006.01) C07H1/06(2006.01) 权利要求书2页说明书6页附图1页 (54)发明名称 一种寡核苷酸脱盐工艺 (57)摘要 本发明涉及生物化学和生物工程领域,具体 公开了一种寡核苷酸脱盐工艺,包括离心预处 理、二次离心、分离洗脱、脱盐纯化处理、进一步 分离洗脱以及脱水干燥处理。本发明使用亲和色 谱柱脱盐提纯,通过向亲和柱内填充带有磁性的 亲和基团固相吸附材料,利用寡核苷酸的特异性 结合去除盐类杂质,依靠外部磁场将寡核苷酸目 标物和盐类杂质分离,最后洗脱得到纯化后的高 浓度寡核苷酸。该工艺简便了寡核苷酸脱盐工艺 的同时也更高效地提纯寡核苷酸,能够更精确地 满足工业需求,促进科研和生物医学领域的发 展。 CN117720604A CN117720604A权利要求书1/2页 1.一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,包括如下步骤: 步骤一,离心预处理:取将寡核苷酸样品溶解在去离子水中,之后在离心机中离心, 5000r/h转速离心处理15min,上清液中包含分离出的核酸; 步骤二,二次离心:将离心机中分离出的上清液转移到另一个干净的离心管中,重复操 作进行第二次离心,以去除颗粒物和杂质; 步骤三,分离洗脱:使用低盐缓冲液进行洗脱核酸,以分离寡核苷酸和其他杂质; 步骤四,脱盐纯化处理:将处理后的寡核苷酸样品倒入清洗后的亲和色谱柱中,让寡核 苷酸样品游离在亲和柱内的固相和流动相中,进行色谱分析,通过亲和色谱柱填充材料里 的磁性亲和基团与寡核苷酸的特异性结合吸附柱内的寡核苷酸; 步骤五,进一步分离洗脱:收集磁性亲和基团吸附后的含有纯化的寡核苷酸的流出物, 进行洗脱分离处理; 步骤六,脱水干燥处理:为了让提纯后的寡核苷酸便于保存,需要收集产物并对其进行 脱水干燥。 2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述步骤四脱盐纯化处 理,选用填充材料为与寡核苷酸互补的DNA和RNA靶标分子结合的配体构成复合亲和色谱柱 的亲和基团固相吸附材料,填充浓度为35%~50%,填充材料所固化的基质为磁铁氧体颗 粒;通过表面涂层的工艺增加表面的疏水性,涂层材料为聚乙烯亚胺;亲和柱内的流动相为 20%浓度的异丙醇溶剂,固相和流动相的添加体积比例为6:4。 3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述磁性微球颗粒通过 加入戊二酮作为活化剂,引入羧基、硫基、酮基;加入竹炭作为阻断剂,减少非特异性核酸结 合;添加量占混合溶液的质量百分比分别为0.5%和0.1%。 4.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述步骤四脱盐纯化处 理,选用的亲和色谱柱的柱结构的外部为圆柱形玻璃材质;亲和柱内部以注塑的硅基材料 作为载体。 5.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述步骤三分离洗脱和 步骤五进一步分离洗脱,洗脱用的低盐缓冲液具体为Tris‑HCL溶液,溶液浓度为20mM至 50mM,PH值为7.8~8.9之间,洗脱步骤在室温条件下进行。 6.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述步骤四脱盐纯化处 理,其反应时间包括平衡时间和结合时间,均在0.5~1.5小时,室温25℃条件,PH值为7.0~ 8.0下进行。 7.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述步骤五进一步分离 洗脱和步骤六脱水干燥处理,具体操作如下: 步骤Q1,使用外部磁场,将磁性吸附材料和上面附着的寡核苷酸吸引到离心管壁或容 器的侧壁,一起分离出混合物,上清液位于中心,去除亲和柱中的上清液,留下附着在磁性 颗粒上的寡核苷酸; 步骤Q2,对目标物再进行一次洗脱,提取磁性吸附材料上的寡核苷酸,以去除任何残留 的盐和其他杂质,得到纯度较高的寡核苷酸溶液; 步骤Q3,收集洗脱后的寡核苷酸溶液,将溶液放置在真空浓缩仪中,在减压条件下去除 水分,提纯脱盐后的寡核苷酸加入荧光标记的引物储存在干燥、PH值7~8、无光照和低温条 2 CN117720604A权利要求书2/2页 件下。 8.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺,其特征在于,所述的亲和色谱柱仪器 功能还包括数据收集和纯度
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