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(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号CN116751304A (43)申请公布日2023.09.15 (21)申请号202310634130.X (22)申请日2023.05.31 (71)申请人鼎康(武汉)生物医药有限公司 地址430074湖北省武汉市武汉东湖新技 术开发区高新二路388号武汉光谷国 际生物医药企业加速器2.1期26、28、 29、30、33、34、35号楼(自贸区武汉片 区) (72)发明人夏松高宏海倪天琪 (74)专利代理机构上海弼兴律师事务所31283 专利代理师黄益澍 (51)Int.Cl. C07K16/46(2006.01) C07K1/18(2006.01) C07K1/22(2006.01)权利要求书1页说明书5页 序列表(电子公布)附图6页 (54)发明名称 一种使用pH梯度进行阳离子层析的抗体纯 化方法 (57)摘要 本发明公开了一种使用pH梯度进行阳离子 层析洗脱的方法,所述方法包括以下步骤:上样、 平衡、洗涤和洗脱;其中,所述洗脱使用缓冲液A 和缓冲液B的溶剂体系进行梯度洗脱,梯度洗脱 从0%‑100%缓冲液B,收集产品;所述的缓冲液A 为10~20mM柠檬酸,pH为4.5~5.5,所述的缓冲 液B为10~20mM十二水合磷酸氢二钠,pH为7.5~ 8.5。本发明仅使用亲和层析和阳离子层析两步 纯化,将蛋白纯度提高到96%以上,节约纯化时 间,提高收率。 CN116751304A CN116751304A权利要求书1/1页 1.一种使用pH梯度进行阳离子层析来纯化抗体的方法,其特征在于,所述方法包括以 下步骤: 上样、平衡、洗涤和洗脱;其中,所述洗脱使用包含缓冲液A和缓冲液B的溶剂体系,从 0%‑100%缓冲液B,进行梯度洗脱,收集产品;所述梯度洗脱优选进行18~35个柱体积; 所述的缓冲液A为10~20mM柠檬酸,pH为4.5~5.5,所述的缓冲液B为10~20mM十二水 合磷酸氢二钠,pH为7.5~8.5。 2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的缓冲液A为20mM柠檬酸,pH为5.0,所述 的缓冲液B为20mM十二水合磷酸氢二钠,pH为8.0。 3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法满足以下条件的一种或多种: 所述梯度洗脱为线性梯度洗脱; 所述梯度洗脱进行20个柱体积。 4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法使用的阳离子填料为CaptoS impact。 5.如权利要求1所述的方法,其特征在于, 所述平衡使用20mM柠檬酸,pH为5.0,和/或, 所述平衡进行5~15个柱体积,优选所述平衡进行5个柱体积。 6.如权利要求5所述的方法,其特征在于, 所述洗涤使用缓冲液A,和/或, 所述洗涤进行5~15个柱体积,优选所述洗涤进行5个柱体积。 7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述阳离子层析之前还包括亲和层析的步 骤;所述亲和层析包括上样、平衡、洗涤和洗脱,以获得应用于阳离子层析的抗体溶液。 8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述亲和层析后还包括对所述抗体溶液进行 离心换液;优选地,所述离心换液使用的缓冲液的pH为5.0,电导小于4ms/cm; 更优选地,所述缓冲液为10mM组氨酸,10mM天冬氨酸。 9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述方法满足以下条件的一种或多种: 所述抗体溶液为双特异性抗体的溶液; 所述亲和层析使用的填料为MabSelectTMPrismA; 所述亲和层析的平衡使用10~30mMPB,120~180mMNaCl,pH6.5~7.5,进行5~15个 柱体积; 所述亲和层析的洗涤使用0.1~1M醋酸钠,0.2~0.8MNaCl,pH4.5~5.5,进行5~15 个柱体积; 所述亲和层析的洗脱使用0.1~1M醋酸钠,pH3.0~4.2,进行3~12个柱体积。 10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述方法满足以下条件的一种或多种: 所述亲和层析的上样量为67mg, 所述亲和层析的平衡使用20mMPB,150NaCl,pH7.0,进行5个柱体积, 所述亲和层析的洗涤使用0.1M醋酸钠,0.5MNaCl,pH5.0,进行5个柱体积, 所述亲和层析的洗脱使用0.1M醋酸钠,pH3.6,进行6个柱体积。 2 CN116751304A说明书1/5页 一种使用pH梯度进行阳离子层析的抗体纯化方法 技术领域 [0001]本发明属于生物制药,特别是涉及一种使用pH梯度进行阳离子层析洗脱的抗体纯 化方法,具体而言是通过使用pH梯度来进行蛋白质单体与聚体的分离,达到去除聚体的目 的。 背景技术 [0002]在抗体药物研发过程中,蛋白质聚集是一种可能发生与生产过程各步骤的现象, 包括发酵和纯化
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