2022107007970一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN114940966B
(45)授权公告日2023.09.29
(21)申请号202210700797.0WO2018006458A1,2018.01.11
(22)申请日2022.06.20AU2020103127A4,2021.01.07
CN110628693A,2019.12.31
(65)同一申请的已公布的文献号CN111474231A,2020.07.31
申请公布号CN114940966ACN112680399A,2021.04.20
(43)申请公布日2022.08.26CN113046291A,2021.06.29
(73)专利权人安阳工学院CN113444678A,2021.09.28
地址455000河南省安阳市高新区黄河大CN114276976A,2022.04.05
道西段EP0424930A1,1991.05.02
专利权人重庆大学CN114807008A,2022.07.29
李余润;王馨;杨丽英;杨斌;宁玲;董志渊.
(72)发明人胡楠李正国张盟唐梦雨酶解时间对灯盏花原生质体产量及活力的影响.
杨蒙蒙马纵横李艳华蔡宇博天津农业科学.2020,(06),第16-18+24页.
张坤朋李鹏涛卢全伟刘乾坤张盟.番茄根尖细胞原生质体分离及单细胞
王涛韦洋洋彭仁海转录组测序分析.农业科技.2023,第1-99页.
(74)专利代理机构安阳金泰专利代理事务所薛其勤等.番茄原生质体分离与培养技术研
(普通合伙)41150究.潍坊科技学院.2017,.
专利代理师王立武IRUMMUKHTAR等.IsolationofMesophyll
(51)Int.Cl.ProtoplastsfromLeavesofDalbergia
C12N5/04(2006.01)sissooRoxb.J.Appl.Sci.Environ.
C12Q1/6806(2018.01)Manage.2012,第16卷(第1期),第11-15页.
C40B50/06(2006.01)林勤;黄述生;李锋;任贤.枸杞、番茄体细胞
原生质体培养体系研究.广东农业科学.2015,
(56)对比文件(第03期),第30-36页.
US5508189A,1996.04.16
CN112695011A,2021.04.23审查员朱兵
权利要求书1页说明书5页附图2页
(54)发明名称
一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备
方法及应用
(57)摘要
本发明公开了一种番茄根尖原生质体单细
胞悬液的制备方法及应用。本发明提供的制备方
法，通过将番茄根尖原生质体通过处理、孵育、酶
解、过滤、离心、活性检测等过程，最终制成单细
胞悬液。采用本发明所述方法制成的植物原生质
体单细胞悬液，细胞活性高达90％以上，可满足
各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要
CN114940966B
求，应用价值高。
CN114940966B权利要求书1/1页

1.一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、番茄种子灭菌后，加入适量无菌水，在摇床中进行孵育，使种子萌发；诱导番茄种子
萌发的具体步骤为：取成熟饱满的番茄种子，24‑28℃摇床20h，待番茄种子露白后，选择生
长状况良好的种子转移至液体1/2MS培养基中，黑暗条件下24‑28℃静置培养24‑48h；
S2、使用超纯水配制制备单细胞悬液所用的溶液，包括甘露醇溶液、酶解液以及洗涤
液，其中酶解液和洗涤液冰浴；
S3、挑选出根部生长良好的番茄幼苗，放入步骤S2中制备好的甘露醇溶液中浸泡；
S4、从S3中选取合适长度根尖区域，用刀片切成根段，转移至S2中的冰浴酶解液中；
S5、将S4中含有根段的酶解液在冰浴状态下抽真空；
S6、将步骤S5制得的酶解液与根段的混合物放入摇床避光孵育酶解；
S7、将步骤S6制得的酶解产物用1mL的宽口枪头转移，通过细胞筛过滤，过滤完成后，向
滤网加入适量洗涤液洗涤残渣，经离心处理，去掉上清液，用宽口枪头加入1mL洗涤液重悬
原生质体并离心，连续处理3次，去掉上清液，制得细胞悬液；
S8、将步骤S7制得的细胞悬液稀释，在显微镜下使用细胞计数板和台盼蓝染色检测细
胞浓度、活性，即可；
所述步骤S2中所述的甘露醇溶液的浓度为0.08g/mL的甘露醇水溶液；步骤S2所述的酶

解液由如下组分组成：0.08g/mL甘露醇、20mMKCL、20mMMES、20mMCaCl2、20mMMgCl2、
0.001g/mL的牛血清蛋白BSA、0.015g/mL的产自绿色木酶的纤维素酶R‑10、0.005g/mL的产
自根霉菌的离析酶R‑10、0.001g/mL的产自日本曲霉的果胶酶Y‑23、2.5‑5.7U/mL的产自棘