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(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号CN114280177A (43)申请公布日2022.04.05 (21)申请号202111534009.7 (22)申请日2021.12.15 (71)申请人上海市徐汇区中心医院 地址200031上海市徐汇区淮海中路966号 (72)发明人陆优丽梁艳茅晓寅张美微 姜凤丽李水军刘罡一余琛 杨双双贺娟 (74)专利代理机构上海申浩律师事务所31280 代理人沈其梅 (51)Int.Cl. G01N30/02(2006.01) G01N30/06(2006.01) G01N30/14(2006.01) G01N30/72(2006.01) 权利要求书1页说明书5页附图2页 (54)发明名称 一种脂溶性维生素A、D、E的检测方法 (57)摘要 本发明提供一种脂溶性维生素A、25羟基维 生素D、E的检测方法,所述检测方法包括以下步 骤:(1)取血液样品进行蛋白沉淀,过滤得上清 液;(2)步骤(1)的上清液中加入2‑亚硝基吡啶的 衍生化试剂进行衍生化反应;(3)衍生化反应终 止后,稀释反应液,通过液相色谱‑串联质谱仪测 定脂溶性维生素A、25羟基维生素D、E的浓度。本 发明衍生化步骤快速、简便;能够快速、准确、可 重现的同时检测维生素A、25羟基维生素D和维生 素E,具有分析时间短,灵敏度高、可实现高通量 检测和自动检测。 CN114280177A CN114280177A权利要求书1/1页 1.一种脂溶性维生素A、D、E的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤: (1)取血液样品进行蛋白沉淀,过滤得上清液; (2)步骤(1)的上清液中加入2‑亚硝基吡啶的衍生化试剂进行衍生化反应; (3)衍生化反应终止后,稀释反应液,通过液相色谱‑串联质谱仪测定脂溶性维生素A、 25羟基维生素D、E的浓度。 2.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中所述血液样品为血浆或 血清。 3.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中沉淀剂中包括以下同位 素内标:VA‑d6,25‑OHVD2‑d6,25‑OHVD3‑d6,VE‑d6。 4.如权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述沉淀剂为甲醇、乙醇、乙腈或二种以 上组分的混合物的水溶液。 5.如权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述沉淀剂为纯甲醇。 6.如权利要求1‑5任一权利要求所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中衍生化 反应时间为10‑20分钟,所述2‑亚硝基吡啶摩尔浓度为5‑50mM,pH1‑3。 7.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述液相色谱条件为流动相A:0.1‑ 0.5%甲酸或者乙酸水溶液和流动相B:0.1‑0.5%甲酸或者乙酸甲醇溶液,使用梯度洗脱法 洗脱获得待测样品,柱温:室温;流速:0.5‑0.7mL/min;进样量:10‑30μL;进样时间:5min。 8.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中加入2‑亚硝基吡啶的衍 生化试剂后,涡旋混匀1分钟,放置室温衍生化反应15min。 9.如权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中加入2‑亚硝基吡啶的衍 生化试剂后,涡旋混匀1分钟,放置室温衍生化反应15min。 10.如权利要求7‑9任一权利要求所述的检测方法,其特征在于,所述串联质谱条件为: 电喷雾离子源:正离子扫描;气帘气:30psi;碰撞气:12psi;雾化气:70psi;加热气:60psi; 离子源电压:5500V;离子源温度:550℃,MRM多反应监测扫描分析。 2 CN114280177A说明书1/5页 一种脂溶性维生素A、D、E的检测方法 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药领域,具体的涉及脂溶性维生素的检测方法。 背景技术 [0002]脂溶性维生素是仅由碳、氢、氧三元素组成的不溶于水而溶于脂肪及非极性有机 溶剂的一类有机物质。这类维生素在食物中多与脂质共存,可随脂质吸收进入人体并在体 内储存。脂溶性维生素摄入量过多易引起中毒现象,如关节疼痛、皮肤干燥、恶心呕吐甚至 厌食,摄入量过少则导致一些生理上的疾病,如新生儿会引起贫血症;儿童易患小儿佝偻 病;成人易引起软骨病和夜盲症等。视黄醇(VA)具有维持正常视力、促进生长发育、增加机 体对传染病的抵抗力、预防和治疗干眼病等作用;缺乏时可引起夜盲症、角膜干燥症、皮肤 干燥、脱屑等疾病。维生素D是一族具有抗佝偻病活性的脂溶性类固醇衍生物,其中25‑羟基 维生素D2和25‑羟基维生素D3为维生素D在体内的储存形式,维生素D对机体有营养意义,能 调节人体内钙和磷的代谢,促进吸收利用,促进骨骼成长,缺乏时可引起佝偻症(青少年)、 软骨症(成年)、骨
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