2013102194346人外周血中造血干细胞的分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN103289954B
(45)授权公告日2015.07.01
(21)申请号201310219434.6
(22)申请日2013.06.05
(73)专利权人南昌大学
地址330031江西省南昌市红谷滩新区学府
大道999号

(72)发明人许恒毅
(74)专利代理机构南昌新天下专利商标代理有
限公司36115
代理人施秀瑾
(51)Int.Cl.
C12N5/0789(2010.01)
审查员代月函

权利要求书1页说明书6页附图2页
(54)发明名称
人外周血中造血干细胞的分离方法
(57)摘要
本发明公开了分离富集外周血中造血干细胞
（hematopoieticstemcell，HSC）的方法，更好地
为造血干细胞进行后续研究提供基础，涉及生物
医学领域。方法包括树状超支聚合物与鼠抗人造
血干细胞单克隆抗体共价偶联、鼠抗人造血干细
胞单克隆抗体修饰的树状超支聚合物再包被长链
生物素分子、鼠抗人造血干细胞单克隆抗体和长
链生物素共修饰的树状超支聚合物捕获外周血样
品中的造血干细胞、链霉亲和素修饰的纳米磁珠
识别并偶联外周血中长链生物素化树状超支聚合
物、被捕获造血干细胞的分离及重悬等步骤。重悬
液可以直接进行后续分析，与传统的细胞分离方
法相比，该方法更适用于在复杂外周血样品中对
造血干细胞进行磁分离，提高了外周血样品中造
血干细胞分离效率。
CN103289954B

CN103289954B权利要求书1/1页

1.人外周血中造血干细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取1.0mg树
状超支聚合物，悬浮于4mL0.01mol/LpH8.0PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二
醛水溶液545μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150r/min的转速下室温反应3.5h；
滴加1mL2.7mg/mL鼠抗人造血干细胞单克隆抗体溶液，使其终浓度达到3mg/mL左右，摇
床150r/min的转速下室温反应24h；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中
透析1d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状超支聚合物-抗体复合物；（2）取27.6
mg长链生物素，悬浮于4mL0.01mol/LpH8.0PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二
醛水溶液545μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150r/min的转速下室温反应3.5h；
加入1.0mg树状超支聚合物-抗体复合物，在摇床150r/min的转速下室温反应24h；减
压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1d；透析结束将得到的溶液冷冻干
燥得长链生物素-树状超支聚合物-抗体复合物；（3）每取1mL正常人新鲜外周血，加入
0.2mg抗体和长链生物素共修饰的树状超支聚合物即步骤（2）长链生物素-树状超支聚合
物-抗体复合物，置于混匀仪上，以30rpm的转速室温孵育15min，加入0.1mg修饰有链
霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30rpm的转速再室温孵育15min，常规磁力架分离
3min；所述纳米磁珠粒径为20-50nm；（4）磁力分离后，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液
重悬即得富集有造血干细胞的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状超支聚合物-抗
体-造血干细胞复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述树状超支聚合物为氨基化的树状超支
化聚酰胺-胺，其分子量为56000Da。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纳米磁珠粒径为30nm。

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CN103289954B说明书1/6页

人外周血中造血干细胞的分离方法

技术领域
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体是涉及基于纳米磁珠的造血干细胞分离方法。

背景技术
[0002]造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）是指具有自我更新能力并能分化为
各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可
以分化成各种其它细胞。近十多年来，随着对造血干细胞的功能认识和研究的不断深入，造
血干细胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation）已成为治疗血液病、恶性肿
瘤的有效方法，亦应用于治疗某些自身免疫性疾病。外周血造血干细胞移植是造血干细胞
移植的一种，是采集某种方法动员的外周血或收集脐血中的干/祖细胞作为移植物移植给
受体，以使其建立正常的造血和免疫功能。然而，正常人外周血中造血干细胞的含量很低，
CD34+细胞仅占外周血单个核细胞0.01%~0.1%，现有方法还无法对外周血中痕量造血干细
胞直接分离和采集。因此，实现人体外周血中造血干细胞的高效富集，从而为探讨造血干细
胞在疾病治疗方面的作用奠