2016107401929 一种同时高产纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN106367409A
(43)申请公布日2017.02.01
(21)申请号201610740192.9
(22)申请日2016.08.26
(83)生物保藏信息
CGMCCNo.127682016.07.14
(71)申请人上海交通大学
地址200240上海市闵行区东川路800号
(72)发明人赵心清白凤武李勇昊张晓月
(74)专利代理机构上海伯瑞杰知识产权代理有
限公司31227
代理人曹莉
(51)Int.Cl.
C12N9/42(2006.01)
C12N1/15(2006.01)
C12N15/80(2006.01)
权利要求书1页说明书6页
C12R1/885(2006.01)
序列表6页附图3页
(54)发明名称
一种同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的
方法
(57)摘要
本发明公开了一种同时高产纤维素酶和β-
葡萄糖苷酶的方法。包括在里氏木霉
(Trichodermareesei)中表达具有纤维二糖酶
活性的多肽获得重组里氏木霉菌株，并利用葡萄
糖转糖苷产物的可溶诱导物作为碳源，进行批式
流加发酵，从而同时生产β-葡萄糖苷酶和纤维
素酶的操作方法。本发明在发酵罐中利用分批补
料发酵技术，培养156h后，重组菌株发酵液中β-
葡萄糖苷酶活性超过300CBU/mL，比出发菌株提
高了60倍以上，同时纤维素酶活性超过50FPU/
mL。本发明克服了现有技术中里氏木霉纤维素酶
系β-葡萄糖苷酶酶活过低的缺点，降低了纤维
素酶复配成本，提高了木质纤维素酶解效率。
CN106367409A
CN106367409A权利要求书1/1页

1.一种同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步
骤：
S1.在里氏木霉(Trichodermareesei)中表达具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽编码的核
苷酸，获得重组里氏木霉；
S2.以含β-二糖的糖液为碳源和诱导物，培养所述重组里氏木霉同时生产纤维素酶和
β-葡萄糖苷酶；所述培养利用含有转苷产生的β-二糖的糖液在发酵罐中分批补料控制发酵
液中的葡萄糖浓度。
2.根据权利要求1所述的同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤
S1中，所述具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽编码的核苷酸选自于真菌、细菌、植物或是通过人
工合成基因获得的或通过蛋白质工程优化后的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述
具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽编码的核苷酸选自来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)
的aabgl1基因。
4.根据权利要求3所述的同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤
S1中，以含有潮霉素抗性基因的pCB301为骨架质粒，依次连接了核苷酸序列如SEQIDNo.1
所示的丙酮酸脱羧酶启动子Ppdc1、SEQIDNo.2所示的aabgl1基因和SEQIDNo.3所示的
pdc1终止子，构建重组质粒。
5.根据权利要求4所述的同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述
构建包括如下步骤：
A1.以里氏木霉基因组DNA为模板，以如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的引物对pdc1
启动子进行扩增，以如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7所示的引物对pdc1终止子进行扩增；利用
ClaI单酶切pCBHYGB载体，利用无缝连接酶将pdc1启动子和终止子一步连接到线性化的
pCBHYGB中，得到载体pCBHYGB-pdc1；
A2.利用如SEQIDNo.8、SEQIDNo.9所示的引物以棘孢曲霉的cDNA为模板进行
aabgl1基因的克隆，利用无缝连接酶将克隆得到的aabgl1基因连接到载体pCBHYGB-pdc1
中，得到重组质粒pCBHYGB-PB。
6.根据权利要求1所述的同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤
S2中，含有转苷产生的β-二糖的糖液是利用葡萄糖或含葡萄糖的糖浆，通过β-糖苷酶催化
的转苷反应制备而得的。
7.根据权利要求1所述的同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤
S2中，所述分批补料具体为：待发酵液中葡萄糖耗尽时将温度降低至25℃，开始流加含β-二
糖的糖液；根据发酵液中葡萄糖浓度调控含β-二糖的糖液的流加速度，使得发酵液中葡萄
糖浓度为0.05g/L-0.30g/L。
8.一种同时高产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的重组里氏木霉，其特征在于，在里氏木霉
中使用Ppdc1启动子表达了外源的β-葡萄糖苷酶基因aabgl1。
9.根据权利要求8所述的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉含有使用
Ppdc1启动子表达了