2018112425710 一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN109212090A
(43)申请公布日2019.01.15
(21)申请号201811242571.0
(22)申请日2018.10.24
(71)申请人天津国科医工科技发展有限公司
地址300300天津市东丽区开发区五经路
16号4号楼
(72)发明人李艳许舒欣李小强胡玮
程文播韩文念
(74)专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理
有限公司12211
代理人张月
(51)Int.Cl.
G01N30/02(2006.01)
G01N30/06(2006.01)

权利要求书3页说明书8页附图2页
(54)发明名称
一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中
25-羟基维生素D的方法及试剂盒
(57)摘要
本发明提供了一种基于液相色谱串联质谱
法检测血清中25-羟基维生素D的方法及试剂盒，
其中，血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱
联用检测方法，包括以下步骤：(1)取血清与内标
工作液于样品管中涡旋混匀；(2)向混匀后的混
合液中加入提取剂，涡旋混匀待净化；(3)待净化
的样品全部上样，待全部上样浸润后静置；(4)用
洗脱剂进行洗脱；(5)收集洗脱液，并用正压装置
将残余的液体压下；(6)将收集的洗脱液经氮气
吹干，加入复溶液复溶，涡旋一段时间后采用液
相色谱串联质谱法进行检测。本发明所述的血清
中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测
方法，可提高检测准确度、精密度以及大大缩短
前处理时间，并提高检测通量。
CN109212090A
CN109212090A权利要求书1/3页

1.一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法，其特征在于：包
括以下步骤：
(1)取血清与内标工作液于样品管中涡旋混匀；
(2)向混匀后的混合液中加入提取剂，涡旋混匀待净化；
(3)待净化的样品在装有填料的柱上上样，待全部上样浸润后静置；
(4)用洗脱剂进行洗脱；
(5)收集洗脱液，并用正压装置将残余的液体压下；
(6)将收集的洗脱液经氮气吹干，加入复溶液复溶，涡旋一段时间后采用液相色谱串联
质谱法进行检测，并通过比较25-羟基维生素D和25-羟基维生素D的内标峰面积来得出待测
血清中25-羟基维生素D的含量。
2.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方

法，其特征在于：步骤(1)中，内标工作液包括25-羟基维生素D2内标和25-羟基维生素D3内
标。
3.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方
法，其特征在于：步骤(1)中，血清的选用量为90-200μL，内标工作液的选用量为5-30μL，涡
旋混匀时间为10s；步骤(2)中，提取剂的用量为90-300μL，涡旋混匀时间为50-120s；步骤
(3)中，静置时间为3-10min；步骤(4)中，洗脱液的用量为1-3mL,且洗脱液均分3-6次洗脱；
步骤(6)中，复溶液的用量为90-200μL，涡旋时间为25-60s；优选的，步骤(1)中，血清的选用
量为100μL，内标工作液的选用量为10μL，涡旋混匀时间为10s；步骤(2)中，提取剂的用量为
100μL，涡旋混匀时间为60s；步骤(3)中，静置时间为5min；步骤(4)中，洗脱液的用量为2mL,
且洗脱液均分4次洗脱；步骤(6)中，复溶液的用量为100μL，涡旋时间为30s。
4.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方
法，其特征在于：步骤(2)中，提取剂为100mM的氢氧化钠水溶液；步骤(4)-(6)中，洗脱剂为
HPLC级异辛烷；步骤(6)中，复溶液为40～60v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50～80v/v％的
甲醇水溶液；优选的，步骤(6)中，复溶液为50v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50v/v％的甲醇
水溶液。
5.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方
法，其特征在于：步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件如下：采用梯度洗脱程
序，0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液作为流动相A，0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液作为流动
相B；优选的，梯度洗脱程序中流动相A采用0.1v/v％的甲酸水溶液，流动相B采用0.1v/v％
的甲酸甲醇溶液。
6.根据权利要求5所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方
法，其特征在于：步骤(6)中，梯度洗脱的参数如下：

。

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CN109212090A权利要求书2/3页
7.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方
法，其特征在于：步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条