2019109688927一种环状DNA的制备方法.pdf

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN110724728B
(45)授权公告日2023.06.06
(21)申请号201910968892.7C12Q1/6844(2018.01)
(22)申请日2019.10.12(56)对比文件
(65)同一申请的已公布的文献号CN109161572A,2019.01.08
申请公布号CN110724728ACN107267499A,2017.10.20
CN108251424A,2018.07.06
(43)申请公布日2020.01.24WO2010094040A1,2010.08.19
(73)专利权人深圳清华大学研究院曹墨菊.植物生物技术概论《.植物生物技术
地址518000广东省深圳市南山区科技园概论》.中国农业大学出版社,2014,.
高新南七道19号清华研究院庄君阳.新型功能核酸探针和等温信号放大
专利权人安序源生物科技（深圳）有限公司策略的研究及分析应用《.中国博士学位论文全
(72)发明人高亚平田晖何筠邓素华文数据库工程科技Ⅰ辑》.2018,B014-68.
伊戈尔·伊万诺夫Chu-shuZhu等.AvenuesTowardmicroRNA
DetectionInVitro:AReviewofTechnical
(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有AdvancesandChallenges《.Computational
限公司44205andStructuralBiotechnologyJournal》
专利代理师朱继超.2019,第17卷第904-916页.
(51)Int.Cl.审查员闫华玉
C12Q1/6806(2018.01)

C12P19/34(2006.01)权利要求书1页说明书5页
序列表1页附图2页
(54)发明名称
一种环状DNA的制备方法
(57)摘要
本公开提供了一种环状DNA的制备方法，所
述环状DNA的制备方法的具体步骤为：(1)首先合
成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链
DNA分子的5’端做磷酸化修饰；(2)然后设计合成
引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与
合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；(3)
将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，
获得退火产物；(4)利用连接酶对得到的退火产
物进行连接反应，得到连接反应产物；(5)利用核
酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；
(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。所述制备
方法简单易操作，且在方法中所使用的材料成本
低，降低了制备环状DNA的成本。
CN110724728B
CN110724728B权利要求书1/1页

1.一种环状DNA的制备方法，其特征在于，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：
(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修
饰；
(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子
两端的核苷酸互补配对；
(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物；
(4)利用SplintR连接酶或T4DNA连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接产
物；
(5)利用ExonucleaseI外切酶和T7Exonuclease外切酶的混合物消化连接产物中未
成环的线性核苷酸；
(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。
2.根据权利要求1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中退火的反
应条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h。
3.根据权利要求1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中退火的反
应体系为合成的单链DNA分子：引导RNA分子：退火缓冲液：去RNA酶水的体积比为1：2：1：7。
4.根据权利要求3中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述退火缓冲液包括：
100mMTris‑HCl、10mMEDTA、和1MNaCl，所述Tris‑HCl的PH值为7.5。
5.根据权利要求1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)连接反应的
条件为：首先16℃反应16h，然后65℃反应20min。
6.根据权利要求1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中连接反应

的体系为连接缓冲液：退火产物：连接酶：H2O的体积比为3：1：2.5：30。
7.根据权利要求1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中核酸外切
酶消化的反应体系为连接产物：ExonucleaseI外切酶：T7Exonuclease外切酶的体积比为
7：1：2。
8.根据权利要求1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中核酸外切
酶消