2020104194730一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN111500677A
(43)申请公布日2020.08.07
(21)申请号202010419473.0
(22)申请日2020.05.18
(71)申请人浙江树人学院(浙江树人大学)
地址312000浙江省杭州市树人街8号
申请人树兰（杭州）医院有限公司
浙江默乐生物科技有限公司
(72)发明人蒋国平麻锦程曾丽贾俊玲
(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理
事务所(特殊普通合伙)
11465
代理人崔自京
(51)Int.Cl.
C12Q1/6806(2018.01)
C12N15/10(2006.01)
C12Q1/6886(2018.01)
权利要求书1页说明书3页附图1页
(54)发明名称
一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提
取方法
(57)摘要
本发明公开了一种核酸助沉剂及改良的循
环肿瘤DNA的提取方法，属于生物技术领域。本发
明公开的核酸助沉剂，由CarrierRNA、Acryl
Carrier、PolyA、糖原中的至少一种与醋酸钠组
合而成。本发明公开的改良的循环肿瘤DNA的提
取方法，通过在血浆样本中添加助沉剂，以提高
样本中游离DNA的检测得率。本发明在提高样本
中游离DNA提取得率的同时，提高了对肿瘤突变
基因的检出率，有助于临床对肿瘤诊断的辅助作
用。
CN111500677A
CN111500677A权利要求书1/1页

1.一种核酸助沉剂，用于循环肿瘤DNA提取，其特征在于，由0.5-1.5μg/μlCarrier
RNA、l-3μg/μlAcrylCarrier、1-5μg/μlPolyA、2-6μg/μl糖原中的至少一种与0.1-
0.6mol/μl醋酸钠组合而成。
2.根据权利要求1所述的一种核酸助沉剂，其特征在于，由1.0μg/μlCarrierRNA、3μg/
μl糖原和0.2mol/μl醋酸钠组合而成。
3.根据权利要求1所述的一种核酸助沉剂，其特征在于，由1.5μg/μlAcrylCarrier、
4.0μg/μlPolyA和0.3mol/μl醋酸钠组合而成。
4.一种改良的循环肿瘤DNA的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)分离血浆样本；
(2)向步骤(1)分离的血浆样本中加入权利要求1-3任一项所述的核酸助沉剂，再加入
200μLProteinaseK，按照磁珠法游离DNA试剂盒进行游离DNA的提取；
(3)将步骤(2)提取到的游离DNA进行PCR检测。

2
CN111500677A说明书1/3页

一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法

技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤
DNA的提取方法。

背景技术
[0002]循环肿瘤基因(ctDNA)，是一种无细胞状态的胞外DNA，来源于死亡肿瘤细胞的体
细胞突变DNA片段，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，为游离DNA。它是一种具备广泛
应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥
重要作用，可应用于肿瘤的液态活检，进行肿瘤的早期筛查诊断。而ctDNA的含量非常低，因
此ctDNA的高效提取成为肿瘤液态活检技术的关键之一，提高ctDNA的提取率可以提高
ctDNA突变的检出率，从而提高肿瘤早期筛查的准确率。
[0003]核酸分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质
分离、核酸纯化等几个主要步骤。核酸的分离和纯化是关键步骤，核酸的高电荷磷酸骨架使
其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用
选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。不同方法得到的核酸提取效
果不一样。
[0004]对于游离DNA(cfDNA)的分离纯化方法主要为酚-氯仿法、硅胶膜吸附柱法和磁珠
法。传统的酚-氯仿法提取效率低、重复性差，且有毒溶剂用量多，操作复杂，容易发生污染。
硅胶膜吸附柱法是结合特定的缓冲溶液、精确的pH和盐浓度实现对核酸的吸附。该方法快
速、核酸纯度高、重现性好，其主要缺点是对小片段核酸的提取效率较磁珠法低，且常用离
液盐条件，对后续的盐分洗涤比较繁琐、冗长。柱提法还存在的一个严重的问题是高速离心
造成的剪切力，容易降解DNA，影响DNA的完整性。目前市场上主要的硅胶膜吸附柱法提取游
离核酸的产品是Qiagen公司的试剂盒，不但价格较昂贵，而且回收率仅约40％。磁珠法核酸
纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生
吸附反应。磁珠提取技术可用于多种样本的批量处理，是自动化、高通量的最佳选择之一，
且操作简便，耗时短，但是市