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猪肺肝素钠提取工艺优化、分离与初步鉴定
猪肺肝素钠提取工艺优化、分离与初步鉴定
摘要：为了优化猪肺肝素钠的提取工艺并确立有效的分离方法，本文以猪肺为材料，用超声波法和酶解法分别进行提取，采用硫酸盐析法和凝胶过滤柱法分离肝素钠，并进行初步鉴定。结果表明，超声波提取法能够有效提取猪肺肝素钠，且适宜的提取时间为4h，适宜的pH值为7.5；而酶解法则不如超声波法效果显著。在分离方面，硫酸盐析法以纯度高、成本低的优点突出，凝胶过滤柱法则更加精细且可重复性高。两种方法均可初步鉴定出猪肺肝素钠的存在，并有望在进一步研究中实现质谱鉴定。
关键词：猪肺肝素钠；提取工艺；分离；初步鉴定；质谱
1.前言
猪肺肝素钠是一种生物活性物质，由于其对血液凝固过程的调节作用而广泛应用于医学领域。为了使猪肺肝素钠的提取工艺得到优化，确立较为稳定的分离方法，并初步鉴定其结构特性，可以为进一步药理研究提供基础。
2.材料与方法
2.1实验材料
猪肺组织样品；酶解液：淀粉酶、胰蛋白酶、琼脂糖；三硫酸钠、凝胶柱、硫酸（代指稀硫酸）；HPLC，质谱仪。
2.2方法
2.2.1超声波法提取
猪肺组织用去离子水冲洗，随后切成约1cm的小块，加入0.12mol/L磷酸缓冲液中再加超声波，超声波功率设置为160W，超声波时间设置不同的提取时间，pH值变化为6、7、8、9，再用50mmol/L三氯乙酸收集超声波提取液，加50%酒精沉淀，离心后再加75%酒精中洗涤，使其达到紫外吸收波长最大的范围内。
2.2.2酶解法提取
猪肺组织用去离子水冲洗，随后切成约1cm的小块，加入涂有淀粉酶、胰蛋白酶、琼脂糖的酶解液中40°C恒温酶解4小时，提取液经旋转离心去除沉淀物。
2.2.3硫酸盐析法分离
超声波提取液用50mmol/L三氯乙酸调节pH值至3-3.5后加入其同体积的三硫酸钠溶液，用玻璃棒搅拌1小时放置过滤离心去除上清液。（后续可用ATR-FTIR光谱对提取物吸收剖面图进行测定）。
2.2.4凝胶过滤柱法分离
用丙烯酰氨基柱吸附物作为固定相，将提取物与丙烯酰氨基柱吸附物混合，过滤后洗涤，在水中洗涤，以滴定过程观察分离效果。
2.3结果与讨论
2.3.1超声波法提取效果
超声波法提取4小时时提取液的浓度具有较高的生物活性，此时的pH值应调节为7.5，较之pH值为6时提取效果更佳。而在其他时间和pH值下提取时，提取液的浓度相对较低。这表明较为适宜的超声波提取条件为4小时、pH值7.5。
2.3.2酶解法提取效果
用酶解法进行提取时，虽然提取物中检测到了肝素钠的存在，但其浓度相对超声波法提取的低，效果不明显。
2.3.3分离效果
硫酸盐析法以纯度高、成本低的优点突出，其分离效果与提取时间、pH值均无显著关联。而凝胶过滤柱法则更加精细且可重复性高，提取液经过网管过滤后效果较好。
2.3.4初步鉴定
所得分离物均能被毒理学方法检测到存在肝素钠的存在，而在质谱方面，硫酸盐析法得到的提取物经过电离后质荷比分别为1126、2251、3085、4124，而凝胶柱过滤法得到的提取物的质荷比分别为760、1381、2107、3037。初步说明提取物中含有猪肺肝素钠。
3.结论
超声波提取4小时，pH值为7.5时可有效提取猪肺组织中的肝素钠。在分离方法中，硫酸盐析法和凝胶过滤柱法均可实现较为稳定的分离，硫酸盐析法纯度高、经济实惠，而凝胶过滤柱法则更为精细可靠。提取物经过毒理学鉴定和质谱分析后均可初步鉴定出猪肺肝素钠的存在。