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猪PEDV与PDC_OV二重RT-PCR检测方法的建立
猪PEDV与PDC_OV二重RT-PCR检测方法的建立
摘要：本文建立了一种猪PEDV与PDC_OV的二重RT-PCR检测方法，该方法灵敏、特异性高，为猪瘟病毒的诊断提供了有效手段。
关键词：猪PEDV、PDC_OV、二重RT-PCR、检测方法
一、引言
猪瘟是一种严重影响猪养殖业的烈性疾病，除了对生猪的影响外，也对整个猪肉行业的稳定带来了威胁。猪PEDV和PDC_OV是引起猪瘟的两种重要病原体，因此快速、准确地检测它们的存在就成为了猪肉行业不可缺少的一部分。RT-PCR检测方法是一种高效、准确的检测方式，本文旨在建立一种猪PEDV与PDC_OV二重RT-PCR检测方法，以提高猪瘟病毒检测的灵敏度和特异性。
二、实验材料和方法
1.材料
（1）PEDV和PDC_OV标准荧光素试剂盒（即使多标记荧光素PCR检测试剂盒）
（2）PEDV和PDC_OV对照病毒（JXA1株、SD-M株）
（3）RNA纯化试剂盒（无机纯）
（4）RNA扩增试剂盒
（5）超净水
（6）PCR仪
2.方法
（1）样品处理：从猪粪便或血液等样品中提取RNA，使用RNA纯化试剂盒将RNA提取出来，采用超净水进行稀释。
（2）反转录扩增：准备PEDV和PDC_OV的引物和探针，根据PEDV的ORF1a和PDC_OV的非结构蛋白N基因进行RT-PCR反转录扩增，同时检测猪β-actin基因作为内参控制，PEDV和PDC_OV的反转录采用RNA扩增试剂盒进行。
（3）PCR检测：在PCR仪上进行PCR扩增，扩增温度和时间为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃35s，共35个循环。
（4）检测结果：利用荧光素PCR检测方法读取PCR扩增产物的荧光强度，将荧光结果分别按照PEDV和PDC_OV进行分析，同时将猪β-actin基因作为内参控制。
三、实验结果
本文所建立的猪PEDV和PDC_OV二重RT-PCR检测方法在SD-M和JXA1两株PEDV和PDC_OV对照病毒中均发现了明显的荧光信号，同时猪β-actin基因也被检测到，且其荧光强度相等，表明建立的PCR检测系统的可靠性和准确性较高。
图1.猪PEDV和PDC_OV二重RT-PCR检测结果示意图
四、讨论
本文建立的猪PEDV和PDC_OV二重RT-PCR检测方法采用了PEDV的ORF1a和PDC_OV的非结构蛋白N基因引物和探针，这两项基因都是PEDV和PDC_OV的重要基因，具有很高的保守性和特异性。采用PEDV和PDC_OV标准荧光素试剂盒读取PCR扩增产物的荧光强度，使检测结果更加准确和可靠。
本文所建立的检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，可以应用于猪PEDV和PDC_OV的检测和诊断。
五、结论
本文建立了一种猪PEDV和PDC_OV的二重RT-PCR检测方法，采用PEDV的ORF1a和PDC_OV的非结构蛋白N基因引物和探针，利用PEDV和PDC_OV标准荧光素试剂盒检测PCR扩增产物的荧光强度，使结果更加准确和可靠。该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，可以应用于猪PEDV和PDC_OV的检测和诊断。