转染试剂精华精辟.ppt

2常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。细胞转染方法介绍利用载体分子

2.阳离子脂质体

阳离子lipids和中性lipids混合便会形成单层脂质体(liposome),带正电
高效转染,但需要繁琐的反应条件优化过程

RAS产品:
DOTAP:单价阳离子脂质体
DOSPER:多价阳离子脂质体

3.多组分转染试剂

3.多组分转染试剂

包括lipids和其它活性成分
低毒,高效,无需反应条件优化过程

FuGENE6:已证实可转染超过600种细胞株

优势:
剂量依赖性不明显,无需抗生素存在,极低的血清干扰性II物理方法

电击,基因枪,微注射
主要应用于植物细胞,细菌(带有细胞壁)

III病毒载体

费时和生物安全的考量,应用非常局限影响转染效率的主要因素有：
1、细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前24小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。2、血清
大多数培养基在使用前需要加血清。通常血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。3、载体构建
转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA、RNA、PCR产物、寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因相同载体构建的正对照可排除毒性影响的干扰。4、DNA质量
DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），需要在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。5、转染技术
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。通常影响转染效率的因子161718192021222324252627282930313233