Western blotting.ppt

蛋白质免疫印迹
（Western-Blotting）一、实验安排二、实验原理
1.免疫印迹的概念与基本原理
免疫印迹（westernblotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应（ELISA）高特异性和高敏感性相结合。免疫印迹的基本步骤
蛋白质样品的制备
蛋白质的SDS-PAGE电泳
蛋白质的膜转移
封闭与抗原抗体反应
显色（显影）反应蛋白质的膜转移
原理：将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极（如图）。窃坡咆撞句鹤惋呈爪花畸孕线剔粳返玖减冬疗情神氏音析究接熊搔求永讯WesternblottingWesternblotting转印膜选择转膜确认封闭
什么叫封闭？
加入抗体前需要将膜在封闭剂里进行封闭
为什么要封闭？
让膜的空白处结合上蛋白质
采用什么封闭？
（BSA、脱脂牛奶、明胶、tween-20等）。方法一:直接法方法二:间接法抗原抗体反应
常通过两步法进行免疫反应：一抗（蛋白的特异性抗体）与被检测蛋白直接结合，二抗识别一抗的种属特异性（Fc段），二抗常带有辣根过氧化物酶等标记物等。
例：大鼠抗人P53的抗体（I抗），羊抗大鼠的抗体（II抗）一抗和二抗的选择：
一抗：特异性，灵敏度（单抗，多抗），浓度1:500~1:5000
二抗：HRP活性，耦联效率，浓度(1:10000~1:20000)
HRP，AP，荧光素显色反应
DAB显色：DAB（二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。化学发光（CL/ECL）：该法是基于辣根过氧化物酶在过氧化氢存在的条件下催化鲁米诺（5`-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮），生成一种不稳定的中间产物，当其衰变时即可发光。发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。
一般认为化学发光的灵敏度是DAB法的100倍，是放射活性检测方法的10倍。
多次曝光
节约抗体:其它底物用量1/10－1/1000
反复检测：用不同抗体，对同一蛋白的不同决定簇进行反复检测分析化学显色法:方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测
化学发光法:灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测、选择满意的信号强度
同位素法:灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短
荧光底物法：Krypton™荧光底物三、实验操作
1.试剂的准备
TransferBuffer:
48mMTrisbase5.81g
39mMGlycine2.93g
20%MeOH200ml
total1000ml
TBST:
10mMTris-HCl，1.21g
100mMNaCl
0.2%Tween-20
Total1000ml
pH7.4
DAB底物溶液：
DAB50mg
0.05mol/LTB（PH7.6）100ml
30%H2O230-40l
先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％。2.样品的处理和SDS-PAGE电泳
BSA溶液50l与50l2×上样缓冲液混匀，煮沸5min，上样，每人3孔，每组9孔连续上样（marker5l点在第10孔），其余孔加20l1×上样缓冲液。
电泳时间1小时，电压120~150v。

3.“三明治”和电转移安装好“三明治”，置于电转移槽，黑板负极，白板正极，循环水浴，100v转移1h。
4.封闭和抗原抗体反应3.显色反应
豆温羹据冀亏颖兰卿白惶纲以涧玛蓑靴踪球烩储交雾苏恳酝怪肉舶眠驶队WesternblottingWesternblotting四、关于内参和多次印迹问题strippingbuffer（P161）：
62.5mmol/LTris-cl（pH6.8）
2%SDS
100mmol/L巯基乙醇

哨养厕词瓤腰叔寞爱釜哄皇刮串绸拟谎酉督担硅歹皮幂虎专干迢脚套劈界WesternblottingWesternblotting五、常见问题及解决办法3.样品中待检测蛋白质的含量
采用目前的技术，浓度低至0．1ng的蛋白亦可被检出
4.背景问题
非特异性条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异性抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原类似表位的多肽发生的交叉反应
①弥散性高背景：可能原因是二抗产生,解决办法:缩短二抗孵育时间；用高浓度的蛋白质来吸附二抗（二抗内加3％BSA）；使用另外的二抗；缩短一抗和二抗的孵育时间；延长每次清洗时间。非特异性背景条带：若用间接检测技术，首先