【生物技巧】第五讲(1)植物细胞悬浮造就技巧.ppt

单细胞的分离1由完整的植物器官分离单细胞1.1机械法具体方法:方法B：叶片研碎、离心研磨介质：40ml
20umolSucrose
10umolMgCl2
20umoltris—HCL(三羟甲基氨基甲烷)
PH7.8

注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。注意：大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分离。
（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形成一种互锁结构）事例分离篱天剑叶肉细胞的机械方法1.2酶解法1.3机械法和酶解法比较2由培养组织（愈伤组织）分离单细胞摇床用于振荡植物细胞悬浮培养技术
（Suspensionculture）1、起始悬浮液的制备2、悬浮培养的基本形式2.1分批培养（Batchculture）2.1.2特点2.1.3继代的方法和最佳时期继代最佳继代时期：
选择指数生长期和直线生长期。2.1.4细胞生长曲线滞后期
(lagphase)滞后期
(lagphase)指数生长期
(exponentialphase)直线生长期
(linearphase)减慢期
(progressivedecelerationphase)生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。小结：
（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。
条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。
（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持指数生长期。
（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。2.2连续培养（Continuousculture）开放式和封闭式区别连续培养意义：
植物细胞代谢调节的研究
某种生长限制因子对细胞生长的影响
次生物质的大量生产
紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg由悬浮细胞再生植株的途径3细胞悬浮培养的培养基3.2条件培养基3.3培养基的振荡3.4悬浮培养细胞的同步化3.4.1物理方法3.4.2化学方法3.4.2化学方法4悬浮培养中细胞生长量的计算细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽滤，称重。
细胞干重：60℃干燥12h，称重。
以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。
5培养细胞活力的测定FDA法的原理FDA思考题：