蛋白提取方法.doc

ﻫ1材料与方法1、1材料1、1、１组织与细胞得来源:ﻫ１。1、2仪器设备ﻫ机械组织匀浆器ﻫ低温高速离心机(＞40,０0０g)超速离心机ﻫ超生细胞破碎仪超纯水装置ﻫﻫ1、1。3试剂三氯醋酸(TCＡ)丙酮二硫苏糖醇(DＴT)ﻫ尿素ﻫCＨAＰSﻫPMSFﻫEDTAﻫ乙醇ﻫ磷酸考马斯亮蓝Ｒ3５0ﻫ抑肽素Ａﻫ亮肽素试剂纯度均应就是分析纯或以上。ﻫ1。１、４溶液配制ﻫ(1)PBS:ﻫNａCl８g,KCl0、2g,Na２HPＯ41。44g,ＫH2PO4,溶于800ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1L;ﻫ(2)ＥDTA储存液:18.61gNa2EDTA•2Ｈ２O,溶于70ml纯水中,用10mol/LNaOH调节ｐH值至8.0(约需2gＮａＯH颗粒),定容为100ml、可高压灭菌后分装备用;ﻫ(３)亮肽素储存液(50μg/ｍl,100×)１0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50μg/ｍl储液,-２0℃保存;(4)抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×)1mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0μg/ml储液,-2０℃保存;(5)PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×):１７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。ﻫＤTT储存液(1M):ﻫ０。31ｇDTT溶于2ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。ﻫ(7)裂解液:LysisbufｆｅrＡ(９Mｕｒeａ,４%ｗ/vＣＨAＰS,1％w／vDTT,０.5％CAandacｏｃktaiｌofｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)ﻫﻫLysｉsbufferB(7Murｅa,2Mｔhiｏuｒea,4%w/vＣHＡＰS,1％w／vDTT,０、５%CAａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａseinhｉbitors)ﻫLysｉｓbｕｆｆerC40ｍＭTrｉs－base(ｐH9。5)iｎｕltrapｕｒeH2OＬyｓisbufferD(8Ｍurｅa,4％CHＡＰS,4０mMTris(ｂasｅ),40ml)ﻫLyｓｉsbufferEﻫ(５Murea,2Mtｈioｕreａ,2％SB3-10,2％CHAPS,１%w/vDTT,0、５%CＡandａcocktａｉlｏｆproteaｓeinhibitors)ﻫLysiｓbｕfｆeｒＦﻫ100μLSDＳsaｍplesolｕｔion(1%w/vSDＳ,0、3７５MＴｒiｓ－HCl,pH8。8,50mMDTＴ,２5％v／ｖglyｃeroｌ)●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。ﻫ蛋白酶抑制剂混合物［3]ﻫ成分终浓度ﻫ蛋白酶抑制剂混合物PMSF35μg/mloｒ1mMEDTA0、３mg/ml(1ｍM)抑肽素0。7μg/ｍlﻫ亮肽素0、5μg／ｍlﻫ1.2方法ﻫ1。1.1组织蛋白提取方法１、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］ﻫ(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步;(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;ﻫ(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中;(4)蛋白–２0℃沉淀过夜;ﻫ(5)35０00×g(6℃)离心30min;ﻫ将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中;ﻫ(7)-2０℃放置1h;350０0×g(6℃)离心30min;(9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀;(10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液);ﻫ(11)15℃,40000×ｇ,离心1hr;(12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。ﻫ1、2、1。2超速离心法ﻫ(1)取材;ﻫ(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每１g样品加入0.5ml裂解液,使用组织匀浆器匀浆３0ｓ;(３)组织悬液15℃,1０００0×ｇ离心1０ｍin;ﻫ(4)上清液4℃,１5０0０0×g超速离心45min;ﻫ(５)小心避开上层漂浮得脂质层,吸取离心上清6℃4０,00０g再次离心5０min;ﻫ取离心上清。Braｄfｏrｄ法定量,分装后置–７5℃保存。ﻫ1。2、2培养细胞蛋白提取ﻫ1。2.2、1循环冻融法(1)吸出培养液弃去,0。01mol/LPBS洗一次;(2)加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10ｍl离心管中;(3)5０0×g,离心5min;ﻫ(4)弃上清,PBS洗三次(室温,5０0×g,5min),(５)在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendorｆ管中;执行Biofuｇe存储程序8,５00×g5mｉn离心;(7)用200μl微量加液器吸出PBS,弃去;ﻫ吸干残留得PBＳ,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,巴氏滴管混匀,液氮中反复冻融三次(每次置液氮中３s,室温融化),DTT在第一次冻融后加入